菌糠固态发酵法培养多粘类芽孢杆菌SH15的工艺

李玉洋+辛寒晓+范学明+刘丽英+孙中涛

摘要：为提高水稻恶苗病生防菌多粘类芽孢杆菌SH15的固态发酵水平，以农业副产物——菌糠为主要培养基成分，以活菌数及芽孢数为指标，通过单因素试验及响应面试验对菌株SH15的最适工艺进行优化。结果表明，菌株SH15最适工艺：菌糠20 g、麸皮8 g、初始含水量60.75%、硫酸锰0.50%、发酵温度33.21℃、发酵时间144 h。在此条件下，发酵基质中多粘类芽孢杆菌SH15的活菌数、芽孢数、芽孢率分别为5.02×109 cfu/g、4.61×109 cfu/g、91.8%。此工艺为该菌株的工业化生产提供了一定理论依据。

关键词：固态发酵；菌糠；多粘类芽孢杆菌；工艺优化

中图分类号：S482.2+92文献标识号：A文章编号：1001-4942（2017）12-0119-07

Abstract Paenibacillus polymyxa SH15 is a biocontrol strain against Fusarium moniliforme. In order to improve its solid fermentation level， the optimum technology was optimized by using single factor analysis and response surface experiment. The medium was mainly mushroom bran， and the bacteria and spore yields were used as indicators. The results showed that the optimal technology for SH15 was 20 g of mushroom bran， 8 g of wheat bran，60.75% of initial water content， 0.50% of manganese sulfate， and fermented at 33.21℃for 144 hours. Under these conditions， the living bacteria number， the number of spores and spore rates in Paenibacillus polymyxa SH15 fermentation substrate were 5.02×109cfu/g， 4.61×109cfu/g and 91.8%.

Keywords Solid state fermentation； Mushroom bran； Paenibacillus polymyxa

多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）是芽孢杆菌科类芽孢杆菌属的革兰氏阳性菌，可产生多肽抗生素、拮抗蛋白、植物激素等多种生物活性物质，具有促进植物生长、提高作物产量、防治植物病害的作用。据研究表明，多粘类芽孢杆菌对辣椒疫病、番茄早疫病、西瓜枯萎病、番茄猝倒病等多种植物病害均具有良好的防治效果[1-4]，是一类极具开发前景和应用价值的促生细菌和生防细菌。现已作为微生物肥料用于农业生产，取得了良好的应用效果。目前，多粘类芽孢杆菌菌剂的生产主要采用液态深层发酵，虽然生产效率高，但设备投资大，技术要求高，后处理过程能耗高，并产生大量的废水，污染严重。而固态发酵培养基原料来源广、价格低、水耗与能耗小、无废水与废渣排放、无环境污染，作为微生物菌剂的一种清洁生产方式，日益受到重视[5，6]。

多粘类芽孢杆菌SH15是山东农业大学微生物工程实验室从水稻恶苗病发病田健康植株根际土壤中分离、筛选获得的一株有益芽孢杆菌。前期研究表明，菌株SH15对水稻恶苗病防效较高，且促进植株生长，目前已应用于微生物菌剂及微生物肥料制备生产中。

周荣华等[7]采用液态发酵法于5 t发酵罐中培养多粘类芽孢杆菌NR1，芽孢数为5×108 cfu/mL；赵国群等[8]以新鲜梨渣为主要原料于500 mL烧杯中，采用固态发酵法培养多粘类芽孢杆菌D1，芽孢数为47.8×108 cfu/g。因此，为提高水稻恶苗病生防菌多粘类芽孢杆菌SH15的发酵水平，本研究采用固态发酵法培养。一直以来，我国是世界上最大的食用菌生产国，每年产量达2 260×104 t，占世界总产量的75%以上[9]。菌糠是食用菌采收后剩余的栽培基质，随着我国食用菌种植规模扩大，菌糠的产生量日益增多[10]，是一种资源丰富的农业副产物。但目前菌糠只有少量被利用，大部分都被丢弃或焚烧，造成严重的环境污染和资源浪费[11]。菌糠富含有机质，营养丰富，除含有丰富的食用菌菌体蛋白外，还含有大量的纤维素与半纤维素。为此，本研究以菌糠为固态发酵培养基主要成分，不仅可以降低生产成本，增加经济效益，还可以提高菌糠资源的综合利用水平，减少环境污染。本研究通过单因素试验及响应面试验对多粘类芽孢杆菌SH15固态发酵工艺进行优化，以期为该菌株的工业化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要原料 平菇菌糠由泰安市食用菌研究所提供，曬干后过20目筛，其粗纤维和蛋白质含量分别为31.3%和10.2%。麸皮购自泰安市农贸市场，其淀粉和蛋白质含量分别为46.9%和15.7%。

1.1.2 菌种 多粘类芽孢杆菌（P.polymyxa）SH15：由山东农业大学微生物学实验室分离、鉴定并保藏。

1.1.3 培养基 斜面培养基：蛋白胨10.0 g/L，氯化钠10.0 g/L，酵母浸粉5.0 g/L，pH 7.0，121℃高压灭菌20 min。

三角瓶种子培养基：蛋白胨10.0 g/L，氯化钠10.0 g/L，酵母浸粉5.0 g/L，pH 7.0，121℃高压灭菌20 min。endprint

基础发酵培养基：菌糠20 g，麸皮8 g，初始含水量60%。

1.2 试验仪器

超净工作台，苏州净化设备有限公司；立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；生化培养箱，上海博远实业有限公司医疗设备厂；电热恒温培养箱，上海博远实业有限公司医疗设备厂；电热恒温鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；电热恒温水浴锅JY5002、JA1003电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 种子液的制备 种子活化：将多粘类芽孢杆菌SH15接种到斜面培养基上，30℃培养24 h。

种子培养：将活化的种子取1环接种至装有50 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，30℃、180 r/min摇床振荡培养20 h，菌浓度为108cfu/mL。

1.3.2 菌糠与麸皮配比的选择 将菌糠与麸皮以10∶1、10∶2、10∶3、10∶4、10∶5等不同质量比进行混合，并分别称取28 g放入500 mL三角瓶中，121℃灭菌60 min。接入10%的种子液，30℃恒温培养72 h。发酵期间，每隔12 h摇瓶一次，发酵结束后，测定菌体生长量与芽孢数。重复3次。

1.3.3 发酵时间的影响 在基础发酵培养基的基础上，按1.3.2进行发酵培养，每隔24 h取样一次，测定菌体生长量与芽孢数，发酵156 h。重复3次。

1.3.4 初始含水量的影響 在基础发酵培养基的基础上，控制不同的初始含水量，即40%、50%、60%、70%、80%等，按1.3.2进行培养，培养时间144 h，发酵结束后，测定菌体生长量与芽孢数。重复3次。

1.3.5 添加无机盐的影响 在基础发酵培养基的基础上，分别加入0.5%（w/w）氯化钠、碳酸钙、硫酸镁、硫酸锰、磷酸氢二钾，以不添加任何无机盐为对照，按1.3.2进行发酵培养，培养144 h。测定菌体生长量与芽孢数，以评价上述无机盐对菌体生长和芽孢生成的影响。并在此基础上对最适无机盐含量优化，设0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%（w/w）5个浓度。

1.3.6 发酵温度与装瓶量的影响 菌糠发酵培养基调整为菌糠20 g、麸皮8 g，初始含水量60%、硫酸锰0.35 g。分别于不同温度（25、30、33、36、39℃）与不同装瓶量（20、28、40、50、60 g）的条件下进行单因素试验，按1.3.2进行发酵培养，培养144 h，发酵结束后，测定菌体生长量与芽孢数，以确定最佳发酵温度与装瓶量。

1.3.7 响应面试验 在单因素试验的基础上，选取初始含水量、硫酸锰、发酵温度3个影响较大的因素，以活菌数及芽孢数为响应值进行响应面试验，试验因素与水平如表1所示。

1.3.8 活菌数和芽孢数的计数方法 活菌计数方法：采用平板菌落计数法测定样品中活菌数（cfu/g，以湿质量计）[12]。芽孢计数法：将待测样品80℃水浴加热15 min，杀死未产芽孢的细菌，然后再采用平板菌落计数法测定芽孢数（cfu/g，以湿质量计）[13]。

1.4 数据分析

试验数据分析采用统计软件SPSS 22.0，处理间的差异显著性分析采用Duncans新复极差法。

2 结果与分析

2.1 菌糠与麸皮比的影响

本试验采用平菇菌糠作为培养基质。由于平菇菌丝体将基质中难溶性物质分解为可溶性物质，因而适合用作固态发酵培养基。麸皮是小麦面粉加工的副产物，含有较多的淀粉、蛋白质等营养物质，而且价格低廉。因此，在多粘类芽孢杆菌SH15固态发酵时，添加不同比例的麸皮，可以增加菌糠营养和提高菌糠的通透性。由图1可知，纯菌糠作为培养基发酵72 h时，多粘类芽孢杆菌SH15的活菌数仅为1.21×109 cfu/g，与纯麸皮培养时的活菌数差异显著（P﹤0.05），这表明单纯的菌糠并不适合多粘芽孢杆菌SH15生长。随着麸皮含量增加，活菌数大幅度升高，这表明麸皮可改善培养基的营养组成，有利于菌体生长。当菌糠与麸皮的质量比为10∶4时，活菌数达最多，为2.08×109 cfu/g，而后降低。因此，宜选取菌糠与麸皮质量比10∶4作为最佳配比组合，进行下一步研究。

2.2 发酵时间的影响

从图2可以看出，随着发酵时间的延长，活菌数逐渐增加，当发酵144 h时达到最大值，为2.69×109 cfu/g。发酵前72 h，没有观察到芽孢；当发酵96 h时，才有少部分菌体形成芽孢，芽孢率仅为23.1%；此后，芽孢数快速增加，144 h时达最多，为1.97×109 cfu/g。因此，多粘类芽孢杆菌SH15较适发酵时间为144 h。周荣华等[7]研究表明，多粘类芽孢杆菌NR1发酵40 h时，就能形成大量芽孢，而本研究中，多粘类芽孢杆菌SH15芽孢形成缓慢，这与赵国群等[8]研究相符，可能与固态发酵及菌种不同有关。然而，发酵时间长会造成生产效率低和增加染菌机率。因此，缩短多粘类芽孢杆菌SH15于菌糠发酵培养基上的发酵时间有待进一步研究。

2.3 初始含水量的影响

初始含水量是影响芽孢杆菌生长的重要因素之一，含量过高或过低，都不能使芽孢数量到达最大值。含水量较高时，基质多孔性降低，减少基质内气体的体积和交换，还增加染菌机率；而含水量低时，基质膨胀程度低，微生物生长受抑制[14]。图3表明，随着初始含水量的增加，活菌数和芽孢数也逐渐增加，当初始含水量为60%时，活菌数及芽孢数最多，分别为2.69×109 、1.97×109cfu/g。超过60%时，活菌数和芽孢数逐渐递减。

2.4 无机盐对芽孢形成的影响

芽孢不是细菌生活史中不可缺少的部分，而是在不适条件下，产芽孢杆菌形成的一种抗逆性休眠体。它的形成受很多因素影响，其中关键因素包括培养基中无机盐的种类及含量。由图4可知，添加无机盐对菌体生长和芽孢形成影响较大。与未添加无机盐的菌糠发酵培养基（对照）相比，添加氯化钠、碳酸钙、硫酸镁、硫酸锰、磷酸氢二钾均可促进菌体生长，尤其硫酸锰，使活菌数增加了63.9%，达到了4.41×109 cfu/g。然而，无机盐对芽孢形成的影响不同于对菌体生长的影响。添加氯化钠、硫酸镁及碳酸钙抑制了多粘类芽孢杆菌SH15产芽孢，致使芽孢率明显降低，而添加硫酸锰和磷酸二氢钾可促进芽孢形成，尤其是硫酸锰，使得芽孢数达到4.23×109 cfu/g，芽孢率达到95.9%。所以选取硫酸锰作为无机盐。endprint

由图5可知，随着硫酸锰用量增加，活菌数和芽孢数不断增加，当硫酸锰用量为0.5%（w/w）时，活菌数和芽孢数达最大，而后下降。所以选取硫酸锰最佳用量为0.5%。

2.5 发酵温度的影响

发酵温度是影响多粘类芽孢杆菌生长的重要因素之一。由图6所示，在25～33℃范围内，随着温度升高，活菌数和芽孢数都随之增加，且发酵温度为33℃时，活菌数和芽孢数都到达最大值。当发酵温度超过33℃时，活菌数和芽孢数都显著下降。这表明高温不利于多粘类芽孢杆菌SH15的生长和芽孢形成。

2.6 装瓶量的影响

多粘类芽孢杆菌是一类好氧微生物，溶氧对其生长及芽孢形成影响非常大[15]。固态发酵中，培养基装瓶量直接影响氧气供给。由图7可知，随着培养基装瓶量的增加，活菌数和芽孢数呈现下降趋势。这是因为装瓶量增加，导致氧气的供给减少。为此，在实际固态发酵生产中，要特别注意氧气的供给，控制好氧气供给工艺参数。本研究选取较适宜的装瓶量为28 g。

2.7 响应面试验结果

响应面试验结果如表2。采用Design Expert 8.0.6.1软件对试验数据进行二元多项回归拟合，获得活菌数Y1和芽孢数Y2的二元多项回归方程：

Y1=50.01+0.33A+0.065B+0.49C-0.26AB+0.98AC-0.46BC-3.55A2-2.90B2-8.78C2 ；

Y2=45.88+1.08A+0.19B+2.52C-0.053AB+0.95AC-0.28BC-6.25A2-5.57B2-11.01C2 。

方差分析结果如表3所示，活菌数和芽孢数的两个回归模型均高度显著（P<0.01），失拟项不显著（P>0.05），相关系数R2分别為0.9972和0.9950，R2adj分别为0.9936和0.9886，表明其拟合度和可信度均较高，能够很好地对发酵过程进行描述及预测。模型的一次项C、交互项AC和二次项A2、B2、C2对活菌数的影响极显著（P<0.01），一次项A、交互项BC对活菌数的影响显著（P<0.05）；一次项A、C和二次项A2、B2、C2对芽孢数的影响极显著（P<0.01），交互项AC对芽孢数的影响显著（P<0.05）。

为了更直观地反映各因素对响应值的影响，利用Design Expert 8.0.6.1软件绘制其响应面图，如图8和图9所示。

等高线的形状可反映出交互作用的强弱，椭圆形代表两因素交互作用显著，圆形则相反。由图8可知AC、BC交互作用显著，AB交互作用不显著；从图9看出，AC交互作用显著，AB、BC交互不显著，均与表3方差分析结果一致，并且响应面曲面开口向下，存在最大值，说明最佳点在考察的区域内。根据响应面试验结果对活菌数和芽孢数进行回归分析预测，得优化后结果为初始含水量60.75%、硫酸锰0.5%、发酵温度33.21℃，在此条件下，活菌数及芽孢数分别为5.01×109cfu/g和4.60×109cfu/g。

2.8 验证

采用优化后的发酵工艺进行3次验证试验，获得的活菌数、芽孢数分别为5.02×109、4.61×109 cfu/g。实际值与预测值较接近，说明模型能够有效反映各筛选因素对响应值的影响。此外，本研究与赵国群等[8]利用梨渣为主要原料进行多粘类芽孢杆菌D1固态发酵获得的活菌数5.09×109 cfu/g、芽孢数4.78×109 cfu/g的研究结果相接近。

3 结论

本研究以廉价的菌糠为主要成分通过单因素试验及响应面试验对多粘类芽孢杆菌SH15固态发酵工艺进行优化，得到最优工艺为菌糠20 g、麸皮8 g、初始含水量60.75%、硫酸锰0.5%、发酵温度33.21℃、发酵时间144 h。在此条件下，活菌数及芽孢数分别为5.02×109 cfu/g和4.61×109 cfu/g。本研究获得了较高的活菌数及芽孢数，表明菌糠含有丰富的营养物质，是一个良好的固态发酵原料，适合培养多粘类芽孢杆菌SH15。菌糠作为固态培养基成分，不仅解决其被大量丢弃造成的环境污染，而且降低了生产成本，增加了经济效益。

初始含水量对芽孢杆菌的生长影响较大，含水量过低，不利于菌体对营养物质的利用，过高则芽孢游离晚，发酵周期延长[16]。赵国群等[8]用梨渣、麸皮进行多粘类芽孢杆菌固态发酵，初始含水量为58.20%；而本研究最适含水量为60.75%，这可能与培养基成分有关。培养基中添加无机盐对菌体生长和芽孢形成影响很大。赵国群等[8]研究表明，添加质量分数为0.50%磷酸氢二钾极大地促进多粘类芽孢杆菌的生长及芽孢形成；而本研究则添加0.5%硫酸锰对多粘类芽孢杆菌的生长和芽孢形成促进明显，这也可能与培养基成分有关。适宜的温度对微生物生长至关重要。赵国群等[8]研究发现，多粘类芽孢杆菌在34℃生长较好；本试验中，多粘类芽孢杆菌在33.21℃生长最好，二者研究结果相接近。

本研究只在实验室用小体积法对多粘类芽孢杆菌SH15固态发酵工艺进行优化，优化后的工艺成本低，为下一步中试生产提供依据。此外，优化后的工艺是否符合工业化大规模生产还需要进行验证。本研究将进一步对多粘类芽孢杆菌SH15固态发酵菌剂的田间应用进行研究。

参 考 文 献：

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