金银花组培快繁技术研究

郑吉发++杨芳

摘要 为在短时间里比较简便地获得获得大量优质的金银花种苗，采用组培方式选取当年生长健壮的无病虫害的带芽茎段为外植体在春季上午露水干燥后取材，清洁处理后，并用75%乙醇溶液15 s和0.1% HgCl2溶液7 min进行常规灭菌[1]。选用MS+6-BA 0.50 mg/L+NAA 0.1 mg/L+糖30 g/L+琼脂6 g/L生芽诱导培养基进行生芽诱导培养，随后转入到MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+糖30 g/L+琼脂6 g/L的增殖培养基中增殖培养，以求获得更多的繁殖材料，最后以1/2MS+NAA 2.5 mg/L+活性炭200 mg/L+糖30 g/L+琼脂6 g/L为生根培养基进行生根培养，并进行驯化移栽。结果表明，利用金银花当年生长健壮的无病虫害的带芽茎段可以获得健壮的金银花组培苗。通过转接后的增殖培养，扩大原有组培苗的数量从而保证大规模种植的用苗需求，同时为其他金银花组培快繁提供技术借鉴。

关键词 金银花；带芽茎段；组织培养

中图分类号 S567.79 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）22-0114-02

金银花为忍冬科忍冬属植物忍冬（Lonicera Japanica Thunb）及同属多种植物的干燥花蕾，为多年生半常绿藤本植物，既有保健、药用功能，又有观赏和生态功能，因而被国务院确定为名贵中药材之一[2-3]。由于其功效繁多，如清热消毒、消炎、增加抵抗力、抗病毒等，因而被广泛应用于制药、香料、化妆品、食品等领域[4-5]。金银花的主要功能是清热解毒，可以在滥用抗生素带来严重后果的情况下发挥其作用，防治SAS、H1N1病毒病[6]。另外，金银花还含有多种抗氧化活性成分，可降血脂，用于预防治疗心脑血管疾病。由于用量逐年增加，许多地区都在尝试大面积种植。

金银花一般采用扦插、嫁接、分株或压条繁殖，繁殖系数小，育苗周期长，且易传染病菌，品种退化快。由于遇到种苗繁殖这一难题，人工大规模种植都没取得预期效果[7]。

植物组织培养能保持母株的优良性状，具有繁殖系数高，可周年生产，可实现金银花良种苗木规模化工厂生产[7]。本文采用当年生幼嫩的带芽茎段以组织培养的方式进行金银花良种的快速繁殖并取得了一定进展。

1 材料与方法

1.1 试验材料

不同外植体的选择及取材时间对金银花组培外植体的存活和诱导芽的形成影响较大。春秋以顶芽为外植体，而4个季度带有对生叶芽的茎段的灭菌效果较差，易产生褐化、污染和不萌发等情况，成活率很低[8]。为了取材方便，多数仍选用当年生带叶芽的茎段，接种时剪成1.5～3.0 cm长；也可用顶芽繁殖。2016年3月23日10：00取学院药材圃种植的当年生长状况良好、无病虫害、离地面较高的金银花顶芽、茎条作试验材料。

1.2 试验方法

1.2.1 材料预处理。外植体在流水情况下用软毛刷洗去表面的灰尘和附着物等，再剪成段并在流水下冲洗2～4 h。

1.2.2 灭菌。在超净工作台中把清洗好的外植体倒入75%乙醇中灭菌15 s然后倒出酒精，然后用加入1～2滴吐温—80的0.1% HgCl2消毒5 min，灭菌过程中要用手摇灭菌，以加大灭菌效果，最后用无菌水冲洗6～7次，直到起指示作用的吐温—80冲淡到不形成泡沫[9]，再在接种盘里用镊子和解剖刀把材料切成带有1个顶芽或1～2个腋芽的茎段接种到培养基中培养。

1.2.3 培养。把经表面灭菌的金银花顶芽或带侧芽的当年生茎段接种在配置好的培养基中培养，培养室条件为温度23～27 ℃、相对湿度65%～85%、光照强度1 500 lx、光照时间12 h。

2 结果与分析

2.1 启动培养结果

金银花启动培养的培养基为 MS+6-BA.0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+糖30 g/L+琼脂6 g/L。

在接种室超净工作台上按无菌操作要求，将材料接入装有灭菌后启动培养基的试管中，每个外植体接1个试管按要求包好试管。为防止污染每接种5～6个外植体对接种工具进行消毒1次。金银花外植体共接种50个，接好后转入人工控制的培养室中。在培养室培养5 d后转接材料开始萌动，经过10 d顶芽开始逐渐变绿，也逐渐伸长。带腋芽的茎段也变得更绿，剥离葉柄处开始凸起，基部形成的瘀伤组织也渐渐增大，4周后形成丛生芽（表1）。总体上看成活率比较理想，但是出现的问题也不少，在灭菌过程中出现材料失活率大、真菌和细菌污染问题。茎尖失活5株、茎段失活6株，在随后的培养过程中有4瓶真菌和2瓶细菌污染并出现了1瓶材料褐化。

分析原因：一是材料老嫩不一，灭菌时没有按材料情况分等级后再进行分批控制时间灭菌，从而导致部分材料灭菌时间过长失活。二是经高温灭菌的镊子和解剖刀未充分冷却就进行操作或者镊子拿捏材料时用力过大损伤材料。三是人员不正确操作增加了污染几率。四是灭菌过程中，细菌在应对恶劣环境时形成的一种特殊结构的芽孢，这种芽孢帮助细菌渡过难关。当环境条件恢复后，芽孢又重新变为细菌。

2.2 金银花增殖培养结果

外植体经诱导培养20 d后，发出多个新芽，30 d后新芽梢长成细嫩的茎段。切取丛芽接种于增殖培养基（MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+糖30 g/L+琼脂6 g/L）中增殖培养，15 d后长出丛生芽，切取丛生芽转接于新的增殖培养基上，则可以在更短的时间内长出丛生芽，增殖培养次数越多，从接种到长出丛生芽的时间就越短，但不短于1周。若不及时转接，基部会长出大量玻璃状物质，且试管苗会迅速长高同时变得纤细，导致苗的质量变差。

在组织培养过程中，要想获得试管苗的快繁高效性，植物生长调节剂是最重要的因素[10]。为了确定最适的比例，配制了以MS为基本培养基，另加入不同的种类和浓度的激素培养基（表2）。在试验中发现，6-BA/NAA比值越大，越有利于芽的分化生长。MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L增殖周期为20～25 d，增殖倍数为3～4倍，虽然芽的分化量较少，但分化的芽丛都为有效芽，为最佳培养基。在增殖培养时，所切取的增殖丛生芽苗所保留的腋芽数量对增殖速度有一定影响，将保留2、1个腋芽的丛生芽苗接种在同一培养基上，保留2个腋芽的生长速度明显比保留1个芽的苗快，理论上达到同样繁殖系数的年增殖次数前者明显少于后者3～4次，产苗量大幅度提高。建议在工厂化快繁时，最好采用保留2个腋芽的苗进行快繁。endprint

在增殖培养过程中由于转接技术有限，仍存在一些污染问题，如接种时手握镊子的部位过低，试管偏长，在材料接入试管的过程中手握过的部位伸入试管中，接触试管内壁造成细菌污染。在接种完成后，试管密封不严，空气中的真菌孢子通过封口处的缝隙落入培养基中造成真菌污染。

2.3 诱导生根培养结果

当丛芽苗增殖到一定数量后，要分离成单苗转入到生根培养基进行生根诱导。一般认为矿物质含量高有利于枝叶的生长，较低时有利于生根。因此，生根培养基多采用1/2 MS或者用1/4 MS培养基。同时，为了壮苗，避免形成其他丛芽，培养基要去掉全部的细胞分裂素，并加入适量的生长素（IAA、IBA等），一般2 d即可见根源基发生，当颜色洁白、生长正常的根长约1 cm时即可驯化移栽[6]，选取生长健壮、高达2.5 cm的无根小苗接种在生根培养基上。培养15 d左右就能长出白色短根。

增殖培养至5月18日，从增殖情况良好的金银花材料中选取其中粗壮、长度4～5 cm的材料进行生根培养，剩下细小苗继续留下进行壮苗培养和增殖培养（表3）。

生根培养基为1/2MS+NAA 2.5 mg/L+琼脂6 g/L+糖30 g/L+活性碳200 mg/L，pH=5.8，其中铁盐不减半。

2.4 炼苗与移栽管理

试管苗驯化移栽是植物组织培养的最后关键环节。生产实践中，应根据试管苗与实生苗、试管苗的生存环境与自然环境的差异，人为创设从试管苗生存环境逐渐向室外环境转化的过渡条件，以确保试管苗的移栽成活率。选取长有3～4 cm幼根的试管苗连培养瓶一起拿到室外炼苗1～2 d，再打开瓶口，注入少量无菌水，水面高出培养基1～2 cm，炼苗2～3 d，到苗长出新叶时炼苗成功。

轻轻取出试管苗小心洗净根部培养基，再浸泡到多菌灵800～1 000倍液中10 min后移栽，以提高移栽成活率。将处理好的试管苗移入消毒苗灭菌后的基质中（其中珍珠岩∶草木灰∶菜园土=1∶1∶1）。浇透水后用塑料薄膜覆盖，保持一定湿度，并隐蔽遮光培养，培养10 d左右长出新根。植株生长健壮，成活率达90%以上[11]。

3 结论

金银花组培快繁所选的材料为当年生幼嫩的带芽茎段。消毒时间控制得当是启动培养成功的关键。时间过短则灭菌不彻底，时间过长消毒剂对材料的损伤大，直接导致的后果是死亡率高、褐变几率升高。经过几次试验对比，发现所取的材料在75%乙醇中灭菌15 s，然后再在0.1% HgCl2消毒5 min为较恰当的灭菌时间。

金银花幼嫩的茎条生长速度较快，所带菌少，通过灭菌消毒以后，基本可以建立外植体的无菌体系。在无菌体系建立后增殖阶段是快速高效繁殖的关键，对生长调节剂的所选种类及所用浓度有严格的要求。在增殖过程中由于金银花的生长性能较好，对生长素要求不高，一般0.05～0.10 mg/L就可以满足其生长，由于其细胞增殖能力较差，所以对细胞分裂素浓度的要求较高，但是这些调节物质在金银花转接过程中有积累作用，所以每次转接材料的培养基生长调节物质要比上一次稍低，因为处理不当会使其材料在培养过程中变得很茂盛且又细又长，使材料质量变差，同时要控制培养基的水势，以防止材料玻璃化。金银花材料增殖次数不宜过多，这是因为过多则造成分化能力下降，物种抗病能力下降，基因容易发生突变、转型。

试管苗在大田移栽成活意味着整个组培育苗的成功，进而才能达到大规模、快速、高效育苗的目的。在植物组织培养过程中，如何做好试管苗的驯化移栽工作成为重点。在（下转第119页）

（上接第115页）

生产实践中应根据试管苗与实生苗、试管苗的生存环境与自然环境的差异，人为地创设过渡条件，使试管苗能够成功地向室外环境转化，提高移栽成活率[12]。

本文用當年生幼嫩的带芽茎段以组织培养的方式进行金银花良种的快速繁殖，同时进行观察、比较、讨论、分析金银花生产中的部分问题，找出问题的原因，制定解决方案，以扩大金银花种植面积、提高金银花总产量。

4 参考文献

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[11] 李永明.金银花高效栽培技术[M].郑州：河南科学技术出版社，2002.

[12] 况进波.秀山金银花产业发展研究[D].重庆：西南大学，2013.endprint