一株薄荷抑菌内生菌鉴定与抑菌活性分析

张艳翠++谢秋姣++朱卫平++陈东红

摘要 从薄荷里筛选出一株具有抑菌活性的内生细菌（命名为BH2），通过对菌株进行形态学观察和16S rDNA序列分析，表明该菌株属于解淀粉芽孢杆菌。抑菌试验结果表明，该菌株对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、未知霉菌均有抑菌活性。

关键词 薄荷；内生细菌；解淀粉芽孢杆菌；抑菌活性

中图分类号 S681.9 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）17-0068-02

Abstract An endophytic bacterium named BH2 with antibiotic activity from Mentha haplocalx Briq was screened.Morphological observation and 16S rDNA sequence analysis indicated that BH2 belong to Bacillus amyloliquefaciens.Antimicrobial experiments showed BH2 can inhibit the growth of Escherichia coli，Bacillus subtilis，Staphylococcus aureus and an unknown fungus.

Key words Mentha haplocalx Briq；endophytic bacterium；Bacillus amyloliquefaciens；antibiotic activity

薄荷（Mentha haplocalx Briq）为唇形科一年生药食两用植物，其挥发油经加工后得到的薄荷脑等被广泛地应用于医药、食品、化妆品、香料、烟草等工业，具有巨大的经济价值[1]。最近研究发现，薄荷对治疗癌症有特殊功效，薄荷油还具有一定的抗菌活性，其内生真菌在长期的进化中通过基因交流，代谢产物也具备一定的抑菌效果，作为生物抑菌剂具有巨大的开发潜力。

植物内生细菌（endophyte）是指定殖在健康植物组织内，并与植物建立和谐联合关系的一类微生物[2]。随着对其深入的研究，国内外一些学者发现，定殖后的内生细菌可起固氮作用，可分泌植物促生物质，对病虫害起生防作用。引起了微生物学家、生态学家、植病学家的广泛兴趣，近年来成为国内外研究的热点之一[3]。自1993年以来，人们从多种药用植物中陆续分离出产生活性物质的内生菌，药用植物内生菌已成为人们寻找新型骨架化合物药物的重要来源，并具有不可替代的优势[4]。

近几年，国内外对薄荷内生菌的研究主要是内生真菌方面，集中研究的有薄荷内生真菌的多样性及组分的分析、内生真菌对薄荷自身生长、挥发油、精油的影响以及生物防治作用等[5]。此外，薄荷内生细菌仅仅在种类多样性的探究，在生物防治方面的研究很少，而生物防治与人类生活、健康及环境保护息息相关[6]。细菌较真菌繁殖周期短，实验周期短，若能筛选出抑菌性较好的薄荷内生细菌，分离其代谢产物和次生代谢产物，并对活性物质进行筛选鉴定，可能在生物防治方面会有一定的突破。

1 材料与方法

1.1 试验材料

薄荷采自湖南农业大学校园内。抑菌试验用敏感指示菌：大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus sub-tilis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、未知霉菌。培养基：LB固体培养基。

1.2 试验方法

1.2.1 内生菌的分离与纯化。按常规的无菌操作方法，用组织分离法取薄荷新鲜叶及幼嫩茎，按下列程序表面消毒：自来水冲洗后先后经70%酒精漂洗30 s，0.6%过氧化钠漂洗5 min，无菌水冲洗3～5次。将经过处理的样品在无菌条件下切割成小块，接种于PDA固体培养基上；一部分切割的小块在灭菌的研钵中进行研磨并加1 mL水混匀，取适量于LB培养基中并涂布均匀。每种培养基设3个平行组，以最后一次清洗无菌水作对照，于28 ℃温箱倒置培养1周。

1.2.2 抑菌性内生菌的筛选。①平板对峙培养法。针对指示菌为病原菌，吸取病原菌菌液200 μL于LB固体培养基平板中心，吸取200 μL待测菌液于其周围同等距离处点3 处，于28 ℃恒温倒置培养，待菌落长满后观察抑菌效果。②滤纸片法。指示菌与无菌水1∶100混合后取200 μL于LB固体培养基中涂匀。将BH2菌株发酵液在4 ℃下以6 000 r/min离心20 min，保留上清，用60%硫酸铵沉淀4 h后，在4 ℃下以8 000 r/min离心20 min，无菌细菌过滤器进行过滤。取过滤液，用直径6 mm的无菌滤纸浸湿，并置于平板上，28 ℃恒温倒置培养，待菌落长满后观察。

1.2.3 内生菌细菌的鉴定。①形态学分析。将筛选具有较强抑菌性的菌株接种到YEB培养基平板上，于28 ℃培养24 h，观察菌落形态及细胞形态。细胞形态采用革兰氏染色进行观察。②16S rDNA基因的系统发育分析。用CTAB法提取BH2基因组总DNA。根据细菌16S rDNA通用引物，以基因组DNA作为模板进行PCR扩增，产物经纯化后，送公司测序。基于16S rDNA基因序列的聚类分析，利用在线BLAST软件在NCBI GenBank數据库中进行比对；选取同源性高的典型菌株的16S rDNA基因序列作为参比对象，采用Clustal X软件进行多序列比对，然后利用MEGA6软件中的邻接法进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 薄荷内生菌的分离及抑菌测试

从薄荷茎、嫩叶中采用表面消毒方法分离内生细菌，共分离出16株内生细菌，分别命名为BH1～BH11。通过平板对峙试验，筛选出1株可产生光谱抗性物质的的内生菌BH2。其对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌以及未知霉菌均有不同程度的拮抗作用。通过对其发酵液进行硫酸铵沉淀处理后进行抑菌测试，确定抑菌物质存在于上清液中（图1）。

2.2 BH2菌株的鉴定

2.2.1 内生菌的形态学观察。在LB培养基上生长24 h，BH2菌落呈现为白色，不透明，边缘不规则。显微镜观察显示菌体为短杆状，有芽孢，为革兰氏阳性菌（图1）。

2.2.2 16S rDNA 分子鉴定。利用 16S rDNA通用引物进行PCR扩增并测序，得到菌株BH2的DNA序列，通过NCBI在线BLAST程序进行同源比对搜索发现，BH2的16S rDNA 序列与已公布的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens） 具有99%的同源性。然后通过Clustal X1.83和MEGA6软件采用邻接法构建系统进化树进一步确定 BH2与B.amylo-liquefaciens的亲缘关系最近（图2）。综合判定内生菌 BH2为解淀粉芽孢杆菌的一个亚种，故命名为B.amyloliquefacie-ns BH2。

3 结论与讨论

薄荷具有重要的药理价值，其富含挥发性的薄荷油成分，可用于清凉止痒、发汗解热、促透作用、抗早孕、抗着床、抗真菌、抗病毒等；另外，其非挥发性成分可发挥保肝利胆抗肿瘤、乌发、抗氧化等功效[7]。内生菌在与宿主之间长期协同进化的过程中，经常会与宿主之间发生基因的平行转移，从而可能获取部分宿主的特性甚至参与宿主的次生代谢过程。因此，对薄荷内生菌进行分离和研究，希望能发现新的内生菌资源，并开发出潜在的新的活性代谢物。本研究从薄荷中分离到一株内生菌BH2，形态学和分子鉴定表明，BH2属于一种新的解淀粉芽孢杆菌。解淀粉芽孢杆菌作为生防细菌的研究比较多，其能产生多种不同类型的抗菌物质，如抗菌蛋白、伊枯草菌素、几丁质酶等，在植物病虫害防治方面贡献突出[8]。内生菌BH2对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、霉菌的生长具有显著的抑制作用；但其合成的水溶性抗菌活性成分及相应的生物学功能，仍需进一步深入探讨。

4 参考文献

[1] 郭晓恒，刘涛，宋登敏，等.亚洲薄荷内生真菌多样性研究[J].广东农业科学，2013，40（16）：32-34.

[2] KLOEPPER J M.BEAUCHAMP C J.A review of issues related to measu-ring colonization of plant roots by bacteria[J].Can J MICROBIOL，1992，38（12）：1219-1232.

[3] 苗則彦，赵奎华，刘长远，等.我国植物内生细菌对病虫害防治研究现状[J].辽宁农业科学，2003（6）：31-32.

[4] 李东旭，李军，邓振山.薄荷中内生真菌的筛选和初步研究[J].安徽农业科学，2008，36（23）：10011-10012.

[5] 梁越，刘洋，田兆丰，等.薄荷根内生及根际细菌多样性探究[J].生物技术通报，2010（10）：104-115.

[6] 陈泽斌，李冰，王定康，等.薄荷内生细菌的多样性及组成分析[J].浙江农业学报，2016，28（1）：56-63.

[7] 沈梅芳，李小萌，单琪媛.薄荷化学成分与药理作用研究新进展[J].中华中医药学刊，2012（7）：1484-1487.

[8] 车晓曦，李校堃.解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）的研究进展[J].北京农业，2010（3）：7-10.