温度对橡胶树GT1的2n雌配子发生频率的影响

张源源，黄 肖，李维国

(中国热带农业科学院橡胶研究所/国家橡胶树育种中心/农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室，海南 儋州 571737)

温度对橡胶树GT1的2n雌配子发生频率的影响

张源源，黄 肖，李维国*

(中国热带农业科学院橡胶研究所/国家橡胶树育种中心/农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室，海南 儋州 571737)

【目的】本研究旨在揭示环境温度对橡胶树GT1的2n雌配子发生频率的影响，为高效率的收集橡胶树自然三倍体材料和人工施加温度处理诱导橡胶树三倍体，开展橡胶树多倍体育种提供参考。【方法】采用子代多倍体频率估算2n雌配子发生的方法，比较不同地点/年份橡胶树GT1的2n雌配子发生频率，采用相关性分析研究花发育期间的逐日温度对橡胶树GT1的2n配子发生频率的影响。【结果】不同地点的橡胶树GT1的2n雌配子发生频率差异明显，分别在0.71 %～7.01 %，同一地点不同年份间2n雌配子的发生频率具有稳定性。橡胶树GT1的2n雌配子的发生频率与花发育期的平均逐日最低温的相关性极显著，花发育期的温度越低，2n雌配子的发生频率越高。【结论】花发育期的环境温度对橡胶树GT1的2n雌配子发生频率有显著影响，花发育期的温度越低，2n雌配子的发生频率越高。

温度；2n配子；橡胶树

【研究意义】天然橡胶作为重要的工业原料，对社会经济发展起着重要的作用。橡胶树的品种选育和改良，是提高橡胶树产量和改良胶乳品质，推动橡胶产业发展的基础。当前橡胶树育种使用的魏克汉种质存在着遗传背景狭窄的问题，且经过多年的人工杂交，基因型高度杂合，导致难以利用杂种优势。多倍体在利用杂种优势效应的同时具有基因剂量效应，开展橡胶树多倍体育种是解决橡胶树育种面临的困境的有效途径之一，而筛选自然多倍体进行多倍体育种是最为直接的途径。研究环境因素对橡胶树自然多倍体发生频率的影响对高效收集自然多倍体具有重要意义。【前人研究进展】未减数配子(2n配子)发生是开花植物产生多倍体的主要机制[1]，也是林木多倍体育种采用的主要途径之一[2]。研究表明，环境因素尤其是温度，对2n配子的发生有重要影响[3]。通过在大小孢子发生期间人工施加低温、高温处理，已经在杨树[4-6]、杜仲[7]、拟南芥[8]、蔷薇[9]等多种植物中诱导获得了2n配子。未减数雄配子(2n花粉)可以通过测量花粉粒直径[10]直接观察，而2n雌配子无法直接观察，主要通过检测子代多倍体进行间接观察。橡胶树中存在天然多倍体。胡东琼等[11]从橡胶树雄花败育[12]的初生代无性系GT1[13]的实生苗中分离出了三倍体植株。刘阳平于1970年发现了一株橡胶树天然三倍体[14]。张源源从橡胶树GT1的自然授粉子代中检测出3株天然三倍体[15]。Yao et al.从GT1与17个候选亲本的自然授粉子代中检测出8株三倍体[16]。李惠波等[17]证实通过 GT1×PR107自然杂交后代选育出的品种云研77-2和云研77-4为多倍体。众多证据表明，橡胶树GT1可以稳定地产生2n雌配子，但其2n配子发生是否与环境温度有关尚无研究报道。【本研究切入点】橡胶树因其高大乔木且果实发育期长的特性，难以像杨树[5]、拟南芥[8]一样在人工气候箱内进行温度处理，研究温度对橡胶树2n配子发生的影响。然而，橡胶树在中国的种植范围较广，不同种植地区的环境条件差异为研究温度对橡胶树2n配子发生的影响提供了理想的自然温差条件。本研究选取橡胶树花期温度差异较大的不同地区，采用子代多倍体频率估算2n雌配子发生的方法，检测橡胶树GT1的2n雌配子发生频率，分析花期的逐日温度对橡胶树2n配子发生的影响。【拟解决的关键问题】研究花发育期的温度条件对橡胶树GT1的2n雌配子的发生频率的影响，为高效率的收集橡胶树自然三倍体材料和人工施加温度处理诱导橡胶树2n配子发生，开展橡胶树多倍体育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为不同年份从云南省西双版纳傣族自治州景洪市(N22°0′54.03″，E100°47′3.88″，海拔553 m)、西双版纳傣族自治州勐腊县(N21°27′11.66″，E101°33′37.27″，海拔630 m)、德宏傣族景颇族自治州瑞丽市(N24°02′14.66″，E97°49′8.45″，海拔778 m)等地采集的橡胶树GT1自然授粉种子育出的实生苗。不同采集地点的年份信息见表1。

1.2 倍性检测

流式细胞倍性检测参考康向阳等[18]的方法，用流式细胞仪(CyFlow®Ploidy Analyser)进行倍性分析。

1.3 不同地区/年份的温度比较以及与2n雌配子发生频率的相关性分析

橡胶树花期的逐日温度数据来源于云南省气象信息服务中心。不同地区/年份的温度差异采用方差分析、多重比较进行分析，温度对2n雌配子发生频率的影响采用相关性分析进行研究，数据分析在IBM SPSS22中文版中进行。

2 结果与分析

2.1 倍性检测结果

橡胶树GT1子代的倍性检测结果(图1和表1)表明，不同地点的橡胶树GT1子代三倍体的得率差异明显，分别在0.71 %～7.01 %，瑞丽地区的橡胶树GT1子代的三倍体得率明显高于景洪和勐腊地区，而同一地点不同年份的三倍体得率有稳定性。

a：二倍体；b：三倍体 a: Diploid; b: Triploid图1 流式细胞倍性分析Fig.1 Ploidy analysis by flow cytometry

地点/年份Locations/years检测数Numberoftests二倍体株数Numberofdiploids三倍体数Numberoftriploids三倍体得率(%)Frequencyoftriploids景洪20104194163072景洪20122802782071勐腊20151593157716100瑞丽201515261419107701瑞丽201374969752694

2.2 不同地点/年份的橡胶树花期的气温比较

云南不同地点和年份的橡胶树GT1的花期(花芽分化-开花)均在2-3月，选取3月份(橡胶树处于雌花减数分裂到胚囊发育时期)的最高温、最低温为分析对象。方差分析表明不同地点/年份的橡胶树GT1雌花减数分裂到胚囊发育时期的逐日最高温和最低温存在极显著差异，进一步多重比较结果(表2～3)表明，勐腊2015年的逐日最高温与景洪2012年差异不显著，与其它地区/年份差异均极显著，景洪2012年逐日最高温与瑞丽2013年和瑞丽2015年差异极显著，与其它地区/年份间差异不显著，瑞丽2013年和瑞丽2014年无显著差异。景洪2010年、景洪2012年、勐腊2015年的逐日最低温均极显著的高于瑞丽2013年和瑞丽2015年，其余间均不显著。

2.3 气温与橡胶树GT1的2n雌配子发生频率的相关性

不同地点/年份的花期的平均最高温和平均最低温与橡胶树GT1的2n雌配子发生频率的相关性分析结果(图2)表明，2n雌配子的发生频率与减数分裂到胚囊发育时期的平均逐日最高温的相关性不显著，相关系数为-0.817，与花发育期的平均逐日最低温的相关性极显著，相关系数为-0.991。表明减数分裂到胚囊发育期的逐日最低温度对橡胶树GT1的2n雌配子发生频率有显著影响，且温度越低，2n雌配子的发生频率越高。

表2 不同地点/年份的3月份逐日最高温比较

注：同列数据后标的不同大写字母表示不同品种之间差异极显著(P<0.01)；同列数据后标的不同小写字母表示不同品种之间差异极显著(P<0.05)。下同。

Note: Date with different capital letters in the same column indicate statistically significant differences atP<0.01 between clones；Date with different lowercase letters in the same column indicate statistically significant differences atP<0.05 between clones.The same as below.

表3 不同地点/年份的3月份逐日最低温比较

图2 减数分裂到胚囊发育时期的温度与橡胶树GT1的2n雌配子发生频率的相关性Fig.2 Relationship between temperature of gametophyte development period and frequency of 2n female gametes of GT1

3 讨 论

减数分裂是保持亲代和子代染色体数目稳定，保证物种相对稳定的重要机制[19]。减数分裂过程的任何异常，如减数前加倍、染色体配对异常、胞质分离异常、第一次减数分裂缺失、第二次减数分裂缺失、不规则的后期分离、联会突变、减数分裂后融合、二价体分离异常等均会产生2n配子[20-22]。在植物中，可以确认的2n配子发生途径有两类：第一次减数分裂核复原(first-division restitution，FDR)和第二次减数分裂核复原(second-division restitution，SDR)两种。第一次减数分裂时同源染色体联会和分离的缺失(形成单价体)，在第二次减数分裂时同源染色体的两条姐妹染色单体移向两极，最终形成FDR型2n配子。SDR型2n配子是指第一次减数分裂时同源染色体配对和分离正常(形成二价体)，而第二次减数分裂后期的姐妹染色单体未分离或姐妹染色单体分离而细胞质未分离形成的二倍性配子。

2n配子的发生主要由基因控制，但物理环境尤其是逆境刺激对基因的表达起着关键的作用[23-24]。在芸苔属杂种中，低温可以诱导产生23 %的未减数配子[25]。在苜蓿中，温度影响第二次减数分裂的缺失而产生2n雌配子的发生[26]。细胞学研究表明短时间的低温处理会改变末期Ⅱ的径向微管阵列的形成，进而导致减数后胞质分离的缺失和细胞壁的形成[21]。环境因素对控制2n配子发生基因的影响机制尚不明确，而短时间的低温处理可以诱导拟南芥产生未减数配子，可以作为研究逆境对有性多倍化影响的分子和细胞学机制的模式系统[8]。橡胶树GT1可以稳定产生2n雌配子，但不同温度条件下2n雌配子的发生频率不同，可以推测橡胶树GT1具有产生2n雌配子的基因。本研究发现低温环境下橡胶树GT1的2n雌配子的发生频率显著提高，与拟南芥[8][8]相同，而与杨树[6]、杜仲[7]等相反。推测其原因为橡胶树作为热带植物，在进化过程中适应了高温环境，而对低温敏感，低温更易诱导橡胶树产生2n雌配子的基因表达，从而打破雌配子的正常发育进程，提高2n雌配子的发生频率。橡胶树在低于适宜生长温度条件下多倍体发生频率的提高可为橡胶树的抗寒育种提供新的思路。

本研究没有完全排除2n花粉导致三倍体产生的情况，但Yao，et al.证实2n雌配子发生是GT1与17个候选父本的自然授粉子代中筛选出的8株三倍体的唯一来源途径[16]，可以作为本研究中2n雌配子发生为唯一来源的佐证。

4 结 论

本研究表明，温度对橡胶树GT1的2n雌配子发生有显著影响，配子体发育时期的低温可以诱导橡胶树GT1的2n雌配子发生频率的提高。平均最低温10～11 ℃，平均最高温27～28 ℃条件下，2n雌配子的发生频率可以达到7 %左右。本研究结果可为高效率的收集橡胶树自然三倍体材料提供依据，并为人工施加温度处理诱导橡胶树2n配子发生，开展橡胶树多倍体育种提供参考。

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EffectofTemperatureonFrequencyof2nFemaleGametesofDiploidCloneinRubberTree(HeveabrasiliensisMuell．Arg.)

ZHANG Yuan-yuan，HUANG Xiao，LI Wei-guo*

(Rubber Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/ State Centre for Rubber Breeding/Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree, Ministry of Agriculture, P.R.China, P.R.China, Hainan Danzhou 571737,China)

【Objective】This study aimed to reveal the effects of the ambient temperature on the frequency of 2n female gametes of the rubber tree GT1, and to provide reference for efficient collection of natural triploid rubber tree and artificial temperature treatment to induce triploid of rubber tree.【Method】The frequency of 2n female gametes was estimated based on the polyploid frequency of offspring.The frequency of 2n female gametes in different locations / years of GT1 was compared.The person correlation analysis was used to study the effect of daily temperature during flower development on the frequency of 2n gametes in GT1.【Result】The frequency of 2n female gametes in GT1 in different locations was significantly different, ranging from 0.71 % to 7.01 %, and the frequency of 2n female gametes in different years in the same location was stable.The frequency of 2n female gametes in GT1 was significantly correlated with the average daily minimum temperature in flower development.The lower the temperature of flower development period, the higher the frequency of 2n female gametes.【Conclusion】The ambient temperature of flower development had a significant effect on the frequency of 2n female gametes in GT1.The lower the temperature of flower development, the higher the frequency of 2n female gametes.

Temperature；2n gamete；Heveabrasiliensis

1001-4829(2017)12-2634-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.12.004

2017-06-18

中国热带农业科学院基本科研业务费专项资金(1630022015015)；国家天然橡胶产业技术体系(CARS-34)

张源源(1989-)，男，河南南阳人，助理研究员，主要研究方向为橡胶树多倍体育种和诱变育种，E-mail: yuanyuanhill@sina.com，*为通讯作者：李维国，E-mail: leewg23@163.com。

S722.3+5

A

(责任编辑李 洁)