丁酸钠和5—氮杂胞苷对大麦、水稻、玉米、小麦种子萌发及芽苗期生长的影响

侯泽豪+杨飞+商水根+方汉顺+张文英+徐延浩

摘要： 比较1、10、20 mmol/L的丁酸钠溶液和1 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、1 mmol/L、10 mmol/L的5-氮杂胞苷（5-azacytidine，简称5-AC）溶液对大麦、水稻、玉米和小麦等4种作物种子萌发和幼苗生长发育的影响。结果表明，丁酸钠、5-AC处理均可抑制种子萌发、植株株高及根长的生长。受害指数分析结果表明，4种作物对5-AC处理较丁酸钠处理敏感。从顶端生長来看，玉米对丁酸钠处理较敏感，大麦对5-AC处理最敏感。丁酸钠对小麦根系数目增加的促进作用最强；低浓度5-AC对玉米根系数目增加的促进作用最强；但高浓度5-AC抑制根系数目的增加。受害指数关联分析结果表明，丁酸钠、5-AC处理对植物顶端生长点与侧向器官发生组织具有不同的影响，说明丁酸钠、5-AC对不同的器官具有不同的表观遗传调控效果。

关键词： 禾本科作物；丁酸钠；5-氮杂胞苷；种子萌发；幼苗生长；受害指数

中图分类号： S351.5+3 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）22-0073-04

表观遗传是一种不涉及DNA序列改变但可以通过有丝分裂和（或）减数分裂实现代间传递的变异，这些变异主要包括组蛋白共价修饰和DNA甲基化等。表观遗传机制在植物发育、非生物逆境抗性等方面起着关键作用[1]，对油菜[2]、大麦[3]和玉米[4]种子萌发及幼苗建立阶段的研究表明，种子萌发伴随着DNA去甲基化及组蛋白乙酰基化水平的改变。此外，外源激素处理通过改变种子的表观遗传修饰模式而影响种子的萌发[5]。由此可见，表观遗传修饰是控制种子萌发、生长的重要机制。

5-氮杂胞苷（5-azacytidine，简称5-AC）和丁酸钠（sodium butyrate）是2种重要的表观遗传调控试剂。5-氮杂胞苷能降低基因组DNA甲基化水平，丁酸钠可抑制组蛋白去乙酰化酶的活性，提高组蛋白乙酰化水平。5-AC可调控植物的生长发育、促进植株开花、增强作物的耐湿性[6]和耐盐性[7]。5-AC对小麦[8]、白菜[9]、萝卜[10]和菠菜[11]等植物种子的处理结果表明，5-AC可引起基因组DNA甲基化水平的下降，且其表型效应与处理浓度相关[8]。丁酸钠处理能促进水稻花培绿苗的形成[12]，但不能显著提高大麦苗期的耐湿性[6]。与5-AC相比，关于丁酸钠对种子萌发和幼苗发育影响还知之甚少，缺乏丁酸钠与5-AC对作物种子萌发及幼苗生长效应的系统对比研究。

本研究使用不同浓度的丁酸钠溶液和5-AC溶液对大麦、水稻、玉米及小麦进行处理，统计种子萌发率、幼苗株高、根系发育情况以及植株的干质量等指标，系统比较这4种禾本科作物对丁酸钠和5-AC等2种表观遗传试剂处理的敏感性差异，为研究DNA去甲基化、组蛋白乙酰化水平升高对种子萌发和幼苗发育的影响提供依据，为从表观遗传学角度探索种子萌发和幼苗发育积累更多的资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为大麦苏啤3号（Hordeum vulgare L. cv. Supi3）、水稻丰美占（Oryza sativa L. cv. Fengmeizhan）、玉米郑单958（Zea mays L. cv. Zhengdan958）、小麦湘麦10号（Triticum aestivum L. cv. Xiangmai10）。供试大麦、水稻、小麦材料由笔者所在单位保存，玉米购于种子市场。

1.2 试验方法

选取饱满的种子，用75%的乙醇消毒30 s，清水润洗后置于铺有2层滤纸的发芽盒中，分别加入不同浓度的丁酸钠溶液和5-AC溶液，并置于人工气候箱（上海佳语JYC-412）中暗培养24 h之后进行周期性光照培养，光照度为 10 000 lx，光—暗周期为12 h—12 h。大麦和小麦的发芽培养温度为25 ℃/20 ℃（昼/夜），玉米和水稻为35 ℃/30 ℃（昼/夜）。培养期间每天08：00补充1次相同浓度的溶液。

试验包括对照组（清水发芽培养）、5-氮杂胞苷组和丁酸钠组。5-氮杂胞苷（A2385）和丁酸钠（V900464）购自Sigma公司。5-氮杂胞苷（5-AC）组设置5个处理浓度，分别为 1 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、1 mmol/L、10 mmol/L。丁酸钠处理组设置3个处理浓度，分别为1、10、20 mmol/L。每个处理重复3次，玉米每次50粒，其他材料100粒。

1.3 测定指标及分析方法

各试验材料培养7 d后，分别测定每个处理的发芽率（发 芽率=7 d 内总发芽种子数/供试种子数×100%）、株高、种子根长、根系数量以及植株干质量。鲜质量的测定选取玉米10株，其他材料50株。测定其全株（包含已萌发的种子）鲜质量后，105 ℃杀青15 min，60 ℃烘至恒质量，测定植株干质量。

表观遗传试剂处理对各作物、各类组织的伤害程度用表观遗传受害指数评价，受害指数=（对照组织数据-处理组织数据）/对照组织数据×100%。用苗高受害指数评价茎尖生长点的受害程度，用根长受害指数评价根尖生长点的受害程度，用初生根系数量评价根部的侧生器官形成能力。用加权平均受害指数评价每种材料对丁酸钠和5-AC的敏感性，加权平均受害指数={[丁酸钠溶液/5-AC溶液浓度×对应浓度受害指数]之和}/（丁酸钠溶液/5-AC溶液浓度）浓度之和。用SPSS 19.0对试验数据进行统计、方差分析和多重比较（P<0.05）。

2 结果与分析

2.1 丁酸钠和5-AC对4种禾本科作物种子萌发的影响

由图1可知，对照条件下，大麦、水稻、玉米和小麦发芽率分别为96.67%、95.67%、95.67%和96.67%。1 mmol/L的丁酸钠溶液对这4种作物种子的发芽率没有影响；与对照相比，10 mmol/L丁酸钠溶液处理后4种作物的发芽率均降低，分别为90.00%、91.00%、86.67%和84.33%；20 mmol/L 丁酸钠处理大麦、水稻、玉米和小麦的发芽率分别为84.33%、87.67%、80.00%和80.00%。结果表明，丁酸钠浓度越高，对种子萌发的抑制作用越强。

由图2可知，1、50 μmol/L的5-AC溶液处理对4种作物的发芽率影响较小；100 μmol/L的5-AC溶液处理，水稻的发芽率降低5.67百分点（P<0.05），其他作物的发芽率变化较小。1 mmol/L的5-AC溶液处理大麦、水稻、玉米和小麦的发芽率分别降低6.67、5.67、5.67、5.34百分点；10 mmol/L 的5-AC溶液处理这4种作物的发芽率分别降低9.00、7.00、12.34、10.00百分点。

2.2 丁酸钠和5-AC对4种作物株高的影响

由图3可知，与对照相比，1 mmol/L丁酸钠溶液对水稻、玉米和小麦株高的生长无显著影响，对大麦株高表现出促进作用， 株高显著增加 3.24%。 10 mmol/L 丁酸钠溶液处理大麦、水稻、玉米和小麦株高的受害指数分别为19.08%、1756%、58.70%和33.43%；20 mmol/L丁酸钠溶液处理4种作物株高的受害指数分别为39.83%、19.77%、74.95%和 50.93%。

由图4可知，与对照相比，1 μmol/L的5-AC处理对4种作物的株高没有显著影响；50 μmol/L的5-AC处理对大麦、玉米和小麦的株高没有显著影响，但水稻株高显著提高10.14%。100 μmol/L和1、10 mmol/L的5-AC处理，大麦株高受害指数分别为2.20%、9.71%和100.00%，玉米株高受害指数分别为28.38%、57.54%和76.42%。小麦仅在 10 mmol/L 的5-AC处理下株高显著受害，受害指数为 28.97%。水稻株高在100 μmol/L和1 mmol/L的5-AC处理下与对照差异不显著，较50 μmol/L的5-AC处理下降；在10 mmol/L的5-AC处理下的株高较对照显著下降，受害指数为61.64%。

2.3 丁酸钠和5-AC对4种禾本科作物根系发育的影响

由表1可知，大麦在1、10 、20 mmol/L丁酸钠处理下，根长受害指数为9.81%、61.43%、72.15%。玉米在1、10、20 mmol/L 丁酸钠溶液处理下根长的受害指数分别为 14.22%、42.71%、70.09%。小麦在10、20 mmol/L的丁酸钠溶液处理下，根长受害指数分别为29.34%、63.17%。与对照相比，1 mmol/L 丁酸钠溶液显著促进水稻根长的生长，根长增加19.69%，10 mmol/L丁酸钠溶液对水稻根长没有显著影响，而在20 mmol/L丁酸钠溶液处理下根长的受害指数为 18.38%。

由表1还可知，与对照相比，1 mmol/L丁酸钠溶液处理对大麦、水稻、玉米和小麦的初生根系数量没有显著影响；10 mmol/L 的丁酸钠溶液处理大麦、水稻、小麦的根系数量分别增加25.81%、16.95%和22.29%，但对玉米的根系数量没有显著影响；20 mmol/L 的丁酸钠溶液处理大麦、水稻、玉米、小麦的根系数量分别增加14.52%、13.56%、9.05%和34.10%。

由表2可知，大麦和玉米根长受害程度随着5-AC处理浓度增加而增加，浓度从1 μmol/L 到10 mmol/L，大麦根长受害指数分别为11.14%、38.82%、62.26%、73.90%和9169%，玉米根长受害指数分别为25.29%、31.69%、6262%、81.36%和90.30%。小麦根长在 1 mmol/L 的5-AC溶液处理时出现显著受害情况，受害指数为25.91%；10 mmol/L 的5-AC溶液处理与1 mmol/L的 5-AC溶液处理小麦根长受害程度无显著差异。与对照相比，1 μmol/L 至1 mmol/L的5-AC处理对水稻根长生长没有显著影响，10 mmol/L 的5-AC溶液处理时，根长害指数为 85.34%。

由表2还可知，当5-AC浓度由50 μmol/L上升至 1 mmol/L 时，大麦的根系数量随着5-AC浓度增加而增加，在1 mmol/L时根系数量达到最大，较对照增加25.97%；10 mmol/L 的5-AC处理时，大麦根系数量较其他处理显著减少，受害指数为 47.58%。在1 mmol/L的5-AC处理时小麦的根系数量与对照相比显著增加16.76%；在10 mmol/L的5-AC处理时，根部的侧生器官形成能力受到抑制，受害指數为 12.76%。与对照相比，1 μmol/L至1 mmol/L的5-AC处理对水稻根系数量的影响不显著，但在10 mmol/L的 5-AC处理下表现出显著受害现象，受害指数76.27%。玉米的根系数量在5-AC各浓度处理下均无显著变化。

2.4 丁酸钠和5-AC对4种禾本科芽苗期生物量的影响

由表3可知，丁酸钠对4种作物芽苗期的生长整体表现出抑制作用，且浓度越高抑制越强烈。与对照相比，1 mmol/L的丁酸钠溶液对水稻干质量没有显著影响。10 mmol/L的丁酸处理大麦、水稻、玉米和小麦干质量的受害指数分别为2150%、12.28%、12.03%和39.11%。20 mmol/L的丁酸钠处理4种作物干质量的受害指数分别为31.43%、14.75%、18.20%和37.83%。与对照相比，丁酸钠处理对4种作物幼苗的含水量无显著影响。

由表3还可知，大麦干质量的积累在5-AC处理下受到抑制，50、100 μmol/L和1、10 mmol/L处理下的受害指数分别为9.49%、8.72%、22.82%、90.04%。水稻的干质量仅受 10 mmol/L 的5-AC显著影响，受害指数为 24.69%。与对照相比，100 μmol/L和1、10 mmol/L的5-AC处理下，玉米干质量显著下降，受害指数分别为15.11%、19.22% 和2267%。与对照相比，小麦的干质量在100 μmol/L、1 mmol/L 和10 mmol/L的5-AC处理下显著下降，受害指数分别为 9.46%、13.50%和55.47%。与对照相比，5-氮杂胞苷处理也未对作物幼苗的含水量产生显著影响。

2.5 4种作物对丁酸钠和5-AC处理的敏感性与器官反应

加权平均受害指数分析结果（表4）表明，5-AC引起的株高、根长、根系数量受害程度要明显高于丁酸钠处理。从株高和根长的加权平均受害指数来看，玉米对丁酸钠处理最敏感，其次是小麦、大麦，水稻对丁酸钠处理的耐受最强；大麦对5-AC处理最敏感，其次是玉米、水稻，小麦对5-AC处理的耐受最强。从根系数量的加权平均受害指数来看，丁酸钠对小麦的侧向器官发生的促进作用最强，其次是大麦和水稻，并且影响程度相当； 5-AC对玉米、小麦、大麦和水稻的影响主要表现为抑制侧向器官的发生。

对单苗干质量受害指数与株高、根长和根系数量的受害程度的关联分析结果（表5）表明，丁酸钠处理单苗干质量受害指数与株高、根长呈正相关关系，而与根系数量呈负相关关系。除玉米根系数量外，5-AC处理单苗干质量与株高、根长和根系数量均呈正相关关系。玉米的根系数量与5-AC呈负相关关系，但相关系数较低，仅为-0.167 9。结果表明，丁酸钠和5-AC对植物顶端生长点与侧向器官发生组织具有不同的影响。

3 结论与讨论

丁酸钠是一种表观遗传调控试剂，但关于丁酸钠对植物生长发育的调节效应报道较少。结果表明，丁酸钠和5-AC处理整体上抑制株高增加、根系伸长以及干物质的积累，丁酸钠处理对根系数量的发生有一定的促进效果，但 5-AC处理表现为低浓度促进根系数量的发生，而高浓度抑制根系数量的发生。说明丁酸钠和5-AC这2种表观遗传试剂在种子萌发过程引起的表型效应具有相似性，但在植物顶端生长点与侧向器官发生组织中的作用存在差异。前人的研究发现，5-AC对植物生长发育的调控效应与其处理浓度有关[8-10]。通过5个处理浓度的5-AC对4种禾本科作物进行比较也进一步证实5-AC对植物生长发育调节具有浓度效应。低浓度的5-AC对作物某些器官的发生具有促进效应，而高浓度的5-AC对某些器官的发生具有抑制作用。丁酸钠和5-AC处理均抑制株高、根系的生长及干物质的积累，但5-AC的危害较重；丁酸钠溶液处理能促进作物根系数量的发生，而5-AC处理后的促进效应明显不如丁酸钠处理。由此可见，丁酸钠和 5-AC对植物的调控效应并不完全相同。

通过本试验结果可推测，丁酸钠溶液和低浓度的5-AC可能通过抑制根尖生长点和茎尖生长点细胞的生长和分化，促进侧向器官组织细胞的活动。丁酸钠抑制组蛋白去乙酰化酶的活性，提高组蛋白乙酰化水平，从而激活基因表达[13]。有研究认为，丁酸钠也能降低基因组甲基化水平，激活基因表达[14]。一般认为，5-AC能降低基因组DNA甲基化水平，从而激活基因的表达[15]。此前，5-AC对植物的生长发育效应[8，10-11]、促进植物开花[15]、提高植物抗逆性[7]方面已经有了一些研究，结果显示，植物基因组的甲基化水平有所下降。但关于5-AC在不同组织中的效应报道较少。Kruh认为，丁酸钠能作用于不同位置的细胞，但专一性很低[16]。从本研究结果来看，丁酸钠对不同位置细胞具有不同的调控效应。本研究发现，低浓度5-AC处理对茎尖生长点和侧向器官形成细胞具有不同的调控效应，而高浓度的 5-AC 抑制了侧向器官的形成。因此，丁酸钠和5-氮杂胞苷对不同组织的调控效应有待进一步深入研究。

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