滇榛(Corylus yunnanensis)SSR引物的筛选

王泽亮, 郑永琴, 苏 玲, 刘 青, 余明忠

(1. 四川省林业科学研究院, 四川 成都 610081; 2. 四川省洪雅县林场, 四川 洪雅 620364;3.南充市林业科学研究所，四川 南充 637099；4. 四川省茂县林业局, 四川 茂县 623200)

滇榛(Corylus yunnanensis)SSR引物的筛选

王泽亮1, 郑永琴2*, 苏 玲3, 刘 青1, 余明忠4

(1. 四川省林业科学研究院, 四川 成都 610081; 2. 四川省洪雅县林场, 四川 洪雅 620364;3.南充市林业科学研究所，四川 南充 637099；4. 四川省茂县林业局, 四川 茂县 623200)

滇榛是我国西南地区的一个重要榛属资源，本文成功筛选到滇榛9个SSR标记，并对滇榛群体遗传多样性与遗传结构进行了初步分析，结果显示滇榛群体具有中等程度的遗传多样性与遗传分化，这为滇榛遗传改良研究奠定了基础，也有助于推动本地区榛属资源的保护与可持续利用。

滇榛；川榛；简单序列重复；遗传多样性

榛属(CorylusL)植物，属桦木科(Batulaceae)，为落叶灌木或小乔木，全属约有20余种。榛子，与核桃、腰果、仁用杏，并称世界“四大坚果”，含有丰富的微量元素，营养价值高，除了可直接食用外，还广泛用于巧克力、糖果、奶制品、焙烤食品中。

榛属植物原产于北温带，中国有7个种、3个变种，主要分布于我国东北、华北、西北和西南地区[1]。其中，滇榛(C.yunnanensis)主要分布于四川西部及西南部、云南中部、西部及西北部、以及贵州西部等地区海拔 2 000 m～3 700 m的山坡上[1]，由于其根部萌生特性极易形成连片灌丛，是山地生态系统的重要组成部分。我国自上世纪70年代开始了欧榛引种选育、平榛良种选育以及平榛与欧榛的种间杂交育种研究，并陆续选育了一系列优良品种，目前已开始在东北、华北以及西北地区推广[2～3]。然而，滇榛资源尚未有人工利用的报道。

为了有效的开发利用滇榛资源，需要明晰其群体遗传基础。SSR(Simple Sequence Repeat，简单重复序列)分子标记由于具有分布广泛、多态性丰富、稳定、共显性、DNA模版用量少、检测快速、结果分析容易以及适合自动化分析等优点，而被广泛应用于植物群体遗传多样性与遗传结构研究方面[4～7]。榛属植物研究中使用的SSR(Simple sequence repeat，简单序列重复)标记是由美国俄勒冈州立大学Mehlenbacher实验室首先开发利用的，该实验室构建了3个欧榛微卫星富集文库(GAA、CA、GA)，在初始的研究中，Bassil等(2003)从文库中筛选了53个多态性位点[8]，随后，2005年又分别有8个、18个、25个位点被鉴定用于欧榛遗传多样性分析，并成功进行了榛属种间的扩增[9～12]。到目前为止，从上述3个富集文库中，已有超过200个SSR位点被鉴定出来，并广泛应用于榛子遗传多样性、遗传结构分析及遗传图谱构建等。在国内，SSR标记被用于了平榛、毛榛等榛属种质资源的遗传多样性、群体结构及亲缘关系研究方面，并指导了进一步的榛子遗传改良[13～15]。

本研究从欧榛SSR标记中筛选滇榛适用的SSR引物，以期开展滇榛自然群体遗传多样性与遗传结构研究，以进行进一步的滇榛选育与杂交育种。

1 材料与方法

1.1 材料

滇榛材料采集于四川省凉山州，包括冕宁、盐源、木里、喜徳各5份、总共20份材料。调查时，采集新鲜叶片，变色硅胶干燥保存。

1.2 方法

使用Tiangen植物基因组提取试剂盒(DP305)提取滇榛基因组DNA。SSR引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，其中上游引物添加FAM荧光标记。PCR扩增使用Takara Taq 聚合酶(Takara, Dalian, China) ，20 μL反应体系包括： 13.85 μL ddH2O, 2.0 μL 10× buffer, 2.0 μL 2.0 mM dNTP, 0.5 μL of each primer (at 10 μM), 1 μL基因组DNA模版(30 ng～50 ng)， and 0.75 U Taq DNA聚合酶。扩增程序如下: 94 ℃预变性5 min；94 ℃变性20 s，退火温度退火20 s，72 ℃延伸40 s，25个～30个循环；72 ℃延长5 min，4 ℃保存。

退火温度遵循文献中的数据，若凝胶电泳结果不佳，则再在50℃～60℃范围进行调整直至扩增得到清晰产物。PCR产物首由北京睿博兴科生物技术有限公司进行毛细管荧光电泳分型，采用仪器为ABI 3730xl DNA Analyzer (Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)，SSR片段长度由软件GeneMarke version 2.2.0 (SoftGenetics, USA)判读。

SSR分型数据首先利用Excel2007整理整合，然后采用GenAlEx6.502软件计算遗传参数[16]。

2 结果与分析

本文从已发表文献中选择了12对欧榛引物进行滇榛SSR引物的筛选，结果成功获得9对滇榛适用的SSR引物(表1)。利用这9对引物，初步分析了参与引物筛选的4个滇榛群体的遗传多样性，结果见表2、3。

表1 SSR引物序列特征

Tab. 1 Characterization of 9 SSR primers in C. yunnanensis

表2基于SSR位点的遗传参数

Tab. 2 Genetic statistics of 9 SSR loci in C. yunnanensis populations

注： Na：等位基因数；Ne：有效等位基因数；I：Shannon’s 信息指数；Ho：观察杂合度；He：期望杂合度；Fis：群体内近交系数；Fit：群体总近交系数； Fst：群体间遗传分化系数；Nm：基因流

表3滇榛群体遗传多样性

Tab. 3 Genetic diversity ofC.yunnanensispopulations

群体NNaNeIHoHeP(%)A冕宁54.0002.9561.0990.6000.56488.89E盐源53.2222.3270.8970.5780.496100.00F木里53.3332.5740.9580.4670.531100.00G喜徳54.1112.9551.0690.6670.538100.00均值53.6672.7031.0060.5780.53297.22

注： N：群体个体数； P：多态性位点百分率；其余同表2

在总群体中，9对引物总共筛选到58个等位基因，每个位点平均等位基因数为6.444，平均有效等位基因数为3.314，引物Ch01检测到的等位基因数最多，为11个，而Ch08与Ch10检测到的最少，分别为3个。在总群体中，多态性位点的比率为100%，而在4个分群体中，9个位点在盐源、木里、喜徳群体中多态性比率为100%，在冕宁群体中，仅有Ch08为单态性的位点。

有效等位基因数和杂合度是目前广泛应用的群体遗传多样性指标，同时杂合度也反映群体等位基因分布的丰富度和均匀程度[17]。在检测的4个群体中，有效等位基因数介于2.327～2.956，均值2.703，观察杂合度介于0.467～0.667，均值0.578，期望杂合度变动于0.496～0.564之间，平均为0.532。Shannon’s信息指数也是反映遗传多样性的综合性指标，4个群体的Shannon’s信息指数范围为0.897～1.099，平均为1.006。总体来说，检测的4个滇榛群体的遗传多样性处于中等水平，且冕宁群体多样性水平稍高，而盐源群体遗传多样性水平稍低，但整体差异不大。

遗传分化系数(Fst)是衡量群体间分化程度的指标，根据表2中9个SSR位点分析结果，滇榛群体Fst均值为0.0871，说明8.71%的遗传变异存在于群体间，91.29%的遗传变异存在于群体内，群体内的变异是滇榛遗传变异的主要来源。根据Wright的建议，FST值为0～0.05、0.05～0.15、0.15～0.25和大于0.25分别代表群体间的遗传分化很小、中等、较大和很大[18]，基于此，我们认为滇榛群体间的遗传分化处于中等水平。与群体间遗传分化程度中等相一致，滇榛群体间的基因流较高，均值为3.6282。通常认为当Nm > 1时，可以防止群体间由于遗传漂变引起的分化[19]，9个SSR位点在滇榛群体间的基因流值远大于1，说明群体间的基因流动较多，也表明滇榛群体不易因遗传漂变而引起遗传分化。同时从群体平均值上来说，观察杂合度(Ho=0.578)高于期望杂合度(He=0.532)，也表明滇榛群体杂合子过剩，群体间有足够的基因交流，而且差值较小，说明群体接近理想状态的自由交配。这一点也为哈代-温伯格平衡(Hardy-Weinberg)检测证实，通过卡方检验，在4个群体36个位点中有32个位点符合HW平衡状态(P>0.05)。

当然目前对滇榛群体的分析，仅仅是基于较少群体与个体，要获得更准确的结果需要加入更多群体以及每个群体更多的个体。

3 讨论

四川是榛子资源的一个重要分布区，尽管不同文献记述稍有差异，但国内大部分榛子自然资源在该地区均有分布，其中可能具有商品开发价值的包括滇榛、黔榛(C.kweichowensis)、川榛(黔榛、川榛被认为是平榛(C.heterophylla)的两个变种，而梁维坚等则认为川榛可单独作为1种)[1,3,20]，分布在阿坝州、凉山州、甘孜州等地区，由于这些地区独特的气候与地理环境，很可能孕育了适应于四川地域的优良的种质资源，目前国内外仅有少量研究将川榛、滇榛作为试验材料的一部分[15,21～22]，而黔榛目前还未有涉及，因此为了有效的利用这些资源，需要对其开展系统深入的遗传基础研究。另一方面，滇榛、川榛、黔榛分布地区有重叠，分类地位也有一定争议，需要进一步研究；同时一般认为滇榛、平榛、川榛与黔榛的重要形态区别为小枝、叶柄、叶背、果苞是否被毛、叶片形态、叶柄长度以及果苞长度等，仅从形态上进行区分可能会有差错，是否可以筛选种或变种特异的分子标记？

本文从欧榛SSR引物中筛选到9对滇榛SSR引物，并成功对滇榛群体遗传多样性进行了初步分析，这些标记可有效的用于滇榛群体遗传多样性与遗传结构研究，同时也可深入应用于滇榛、平榛、川榛与黔榛的分类研究与区分上。通过这些研究，将有助于推动省内榛子种质资源遗传改良、保护及可持续利用。

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ScreeningofSSRMarkersinCorylusyunnanensis

WANG Ze-liang1ZHENG Yong-qin2*SU Ling3LIU Qing1YU Ming-zhong4

(1. Sichuan Academy of Forestry, Chengdu 610081, Sichuan, China; 2. Hongya Tree Farm, Hongya 620364, Sichuan, China; 3. Nanchong Institute of Forestry,Nanchong 637099,China;4. Forestry Bureau of Maoxian County, Maoxian 623200, Sichuan, China)

C.yunnanensisis an important species of GenusCorylusin southwest China. In this paper, nine SSR markers were successfully characterized and were used to analyze the population genetic diversity and structure ofC.yunnanensis, showing a moderate degree of genetic diversity and differentiation. And all these established the foundation of genetic improvement inC.yunnanensis, and helped to effectively preserve and utilize the germplasm resources of genusCorylus.

C.yunnanensis，C.heterophyllavar.sutchuenensis，SSR，Genetic diversity

2017-07-20

四川省公益性科研院所基本科研项目“榛子优良种质资源调查收集与区域栽培试验”与“四川榛子种质资源遗传多样性研究”。

王泽亮(1978-)，男，博士，副研究员，主要从事林木遗传育种研究，E-mail：wzl-020304@163.com。

*并列第一作者

10.16779/j.cnki.1003-5508.2017.06.014

S664.4

A

1003-5508(2017)06-0055-04