三种类型烟叶五年贮藏过程中TSNAs及其前体物含量变化趋势分析

张梦玥，史宏志，周骏，白若石，王俊，杨兴有，刘扣珠

1 河南农业大学 国家烟草栽培生理生化研究基地/烟草行业烟草栽培重点实验室，郑州450002；2 上海烟草集团北京卷烟厂，北京100024；3 四川省烟草公司达州市公司，达州，635000

烟草特有亚硝胺(tobacco-specific nitrosamines,TSNAs) 是烟草中重要的一类有害成分，由生物碱发生亚硝化反应生成，多年来持续引起人们广泛关注[1-3]。烟草特有亚硝胺主要有4种：N-亚硝基降烟碱(NNN)、4-(甲基亚硝氨)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亚硝基新烟草碱(NAT)、N-亚硝基假木贼碱(NAB)，动物试验表明NNN,NNK具有较强致癌活性。一般情况下，TSNAs在鲜烟叶中几乎不存在，主要在调制和贮藏过程中产生和积累[4-10]。研究证明，白肋烟在贮藏阶段， TSNAs含量可比贮藏前大幅提高[11-12]。贮藏在室温下的白肋烟样品，6个月后TSNAs含量可增加数倍[13]，因此贮藏阶段对于TSNAs含量的增加不容小觑。生物碱和亚硝酸是TSNA的直接前体物,烟叶内TSNA的产生和积累与两者含量密不可分[14-18]。在实际生产中，由于多种原因烟叶于仓库中的自然贮藏时间多达5年以上，所以明确长时间贮藏过程中烟草特有亚硝胺含量的变化有重要意义。目前关于贮藏过程中TSNAs含量变化方面的研究，样品贮藏时间较短，且多数仅局限于单个类型的烟叶。本试验通过对5个产地烤烟、白肋烟和晒红烟样品在5年长时间贮藏期间烟叶TSNAs、生物碱以及硝态氮含量的测定，以揭示长期贮藏过程中不同类型烟叶内三者的变化规律以及三者间的相关关系。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验材料为典型产区 2011 年调制后的上二棚烟叶，包括一种晒烟A（品种为万毛1号）、两种白肋烟B和C（品种为达白1号和TN86）、两种烤烟D和E（品种为红花大金元和中烟100），晒烟A和白肋烟B由四川省达州烟草公司提供；白肋烟C和烤烟D由云南省大理烟草公司提供；烤烟E由河南省平顶山市烟草公司提供。

1.2 试验方法

取调制后的每个类型和产地烟叶10 kg。烟叶去除主脉后，剪成3～5 cm2大小的碎片，充分混匀，2011年12月第1次取样后自然贮藏，每隔4个月进行下一次取样，每次取烟样20 g，分别进行冷冻干燥后磨碎，过60目筛，最终测定TSNAs和生物碱以及硝酸盐的含量,每样品重复测3次。

1.3 化学成分含量的测定

1.3.1 TSNA含量的测定

样品均由上海烟草集团北京卷烟厂进行测定。测定方法为在线SPE-液相色谱质谱联用（SPE-LC-MS/MS）法（SPE-LC：Spark Holland, Symbiosis (Pico)；MS/MS：AB Sciex triple quad 5500）。称取1.0 g烟样，将其放入50 mL锥形瓶中，加入40 µL 4种氘代TSNAs（内标）溶液（5000 ng/mL）和30 mL 100 mmol/L乙酸铵水溶液，在室温下用振荡器（200 r/min）萃取1小时，萃取液过0.45 µm水相滤膜后使用LC-MS/MS检测TSNAs含量[19]。NNN、NNK、NAT和NAB含量之和即为TSNA总量。

1.3.2 生物碱含量的测定

200 mg样品在碱性条件下，用甲基叔丁基醚（MTBE）提取生物碱，通过气相色谱-氢火焰离子化检测器（GC-FID）(Agilent 7890A，Agilent Technologies，USA) 定量分析检测其中4种生物碱的含量，以正十六烷为内标，具体参照Jack 和Bush的方法[20]。

1.3.3 硝酸盐含量的测定

烟叶样品送至美国肯塔基大学烟草化学分析实验室按Burton等[21]方法测定。

1.4 数据分析

采用Excel 2007进行基础数据处理和绘图。运用SPSS 20.0软件建立一元二次方程分析贮藏过程中三者的变化情况并对烟草贮藏过程中TSNA含量和变化量与生物碱、硝酸盐含量和减少量进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 烟草贮藏过程中TSNAs含量的变化

2.1.1 贮藏过程中NNN含量的变化

5年自然贮藏期间NNN含量动态变化规律如图1和表1。由图可看出，晒烟和白肋烟NNN含量上升明显，其中白肋烟B较未贮藏前增加1073.04%，白肋烟C、晒烟A分别增加283.48%、213.80%。烤烟D、E中NNN增加幅度小。不同类型烟叶间NNN含量差异较大。白肋烟显著大于晒烟，且两者均显著大于烤烟。在贮藏期间NNN含量动态变化采用一元二次曲线模型，晒烟以及白肋烟与该模型的拟合程度较高，相关系数均达到0.95以上。

图1 不同类型烟草贮藏过程中NNN含量的变化Fig.1 Changes in NNN content of different types of tobacco during storage

表1 不同类型烟草贮藏过程中NNN含量的变化Tab.1 Changes in NNN content of different types of tobacco during storage

2.1.2 贮藏过程中NNK含量的变化

从不同类型烟草5年自然贮藏期间NNK含量变化（图 2和表2）可看出，随贮藏时间增加，3种类型烟叶NNK含量均逐渐增加，晒烟A NNK含量多于白肋烟B，但差异不显著，两者NNK含量均显著大于白肋烟C、两种烤烟NNK含量最低。白肋烟C和晒烟A增加量最多，分别较贮藏前增加1274.44 %和1167.88 %。其次是白肋烟B，增加818.35%，烤烟D和E NNK含量增加695.59%和72.50%。五种烟叶一元二次曲线模型的拟合程度均达到了极显著水平 。

图2 不同类型烟草贮藏过程中NNK含量的变化Fig.2 Changes in NNK content of different types of tobacco during storage

表2 不同类型烟草贮藏过程中NNK含量的变化Tab.2 Changes in NNK content of different types of tobacco during storage

2.1.3 贮藏过程中NAB含量的变化

从不同类型烟草5年贮藏期间NAB含量变化情况（图3和表3）可看出，随贮藏时间增加，5种烟叶NAB含量均增加。同地区两种类型烟叶NAB含量差异较大，白肋烟显著大于晒烟，白肋烟、晒烟与烤烟NAB之间差异达到显著水平。烤烟D增加率较高，为936.63%。白肋烟B和C增加比例高达779.07%、731.82%，晒烟NAB增加360.53%。晒烟、两种白肋烟模拟方程相关系数均达0.96以上，呈现极显著相关。

图3 不同类型烟草贮藏过程中NAB含量的变化Fig.3 Changes in NAB content of different types of tobacco during storage

表3 不同类型烟草贮藏过程中NAB含量的变化Tab.3 Changes in NAB content of different types of tobacco during storage

2.1.4 贮藏过程中NAT含量的变化

从不同类型烟草5年贮藏期间NAT含量变化（图4和表4）中可看出，贮藏过程中，5种样品中的NAT含量均随时间增加而增加。白肋烟、晒烟中NAT含量、绝对增加量显著大于烤烟，其中白肋烟B中NAT含量显著高于晒烟。白肋烟B和C增加率达520.14%和442.86%。烤烟E和D的NAT含量增加1026.81%和4.92%。

图4 不同类型烟草贮藏过程中NAT含量的变化Fig.4 Changes in NAT content of different types of tobacco during storage

表4 不同类型烟草贮藏过程中NAT含量的变化Tab.4 Changes in NAT content of different types of tobacco during storage

2.1.5 贮藏过程中TSNAs总量的变化

从不同类型烟叶5年贮藏期间TSNAs总量变化情况（图5和表5）可看出，3种类型烟叶TSNAs总量不断上升，且TSNAs总量、变化趋势与烟叶内NNN含量以及变化趋势较相像。白肋烟B的TSNAs总量、增加幅度最大，白肋烟C和晒烟A的TSNAs总量以及变化量差异不明显，但大于两种烤烟，同类型烟叶中，白肋烟B TSNAs总量显著大于白肋烟C，此结果可能与NNN含量差异较大有关。

图5 不同类型烟草贮藏过程中TSNAs总量的变化Fig.5 Changes in total TSNAs content of different types of tobacco during storage

表5 不同类型烟草贮藏过程中TSNAs总量的变化Tab.5 Changes in total TSNAs content of different types of tobacco during storage

2.2 烟草贮藏过程中生物碱含量的变化

生物碱是烟草特有亚硝胺的直接前体物[5],取经过5年自然贮藏的3种不同类型烟叶，对其生物碱含量进行测量， 得到生物碱含量的变化规律，并采用一元二次模型进行动态模拟。

2.2.1 贮藏过程中烟碱含量的变化

从烟碱含量的测量结果（图6和表6）可以看出，晒烟A烟碱初始量最高,其次为白肋烟B,烤烟烟碱含量最低。同类型烟叶中，白肋烟B烟碱含量显著大于白肋烟C,烤烟E显著大于烤烟D。从图中可以看出，3种类型烟叶烟碱含量随贮藏时间增加逐渐减少，其中白肋烟C下降幅度最大，较未贮藏前下降26.30%。白肋烟B和晒烟A生物碱含量下降程度相近，分别下降14.13%和14.96%,烤烟E和D烟碱分别下降了18.91%和17.29%。

图6 不同类型烟草贮藏过程中烟碱含量的变化Fig.6 Changes in nicotine content of different types of tobacco during storage

表6 不同类型烟草贮藏过程中烟碱含量的变化Tab.6 Changes in nicotine content of different types of tobacco during storage

2.2.2 贮藏过程中降烟碱含量的变化

从不同类型烟叶自然贮藏期间降烟碱含量变化（图7和表7）可看出，白肋烟降烟碱含量最高，显著高于晒烟和烤烟样。晒烟A和两种烤烟降烟碱含量差异不明显。同类型烟叶中，白肋烟B降烟碱含量显著高于白肋烟C。两种烤烟降烟碱含量接近。3种类型烟叶降烟碱含量呈现出下降趋势，其中白肋烟C下降幅度最大，较未贮藏前下降36.59%，其次是白肋烟B，降低了31.01%，晒烟A减少20.14%，烤烟E和D降烟碱含量少，但下降率较高，分别为36.27%和31.38%。

图7 不同类型烟草贮藏过程中降烟碱含量的变化Fig.7 Changes in nornicotine content of different types of tobacco during storage

表7 不同类型烟草贮藏过程中降烟碱含量的变化Tab.7 Changes in nornicotine content of different types of tobacco during storage

2.2.3 贮藏过程中假木贼碱含量的变化

从不同类型烟草自然贮藏期间假木贼碱含量变化中（图8和表8）可看出，5种烟样的假木贼碱含量均逐渐下降，而下降的速度不一，烤烟D下降率为27.94%，其次是两种白肋烟，其中白肋烟C比白肋烟B下降趋势更明显，分别较贮藏前下降22.22%、15.38%。而晒烟假木贼碱仅较未处理前下降11.63%。晒烟A贮藏前假木贼碱含量最高，显著高于白肋烟B，白肋烟C和烤烟D之间差异未达到显著水平，但两者均显著大于烤烟E。

图8 不同类型烟草贮藏过程中假木贼碱含量的变化Fig.8 Changes in anabasine content of different types of tobacco during storage

表8 不同类型烟草贮藏过程中假木贼碱含量的变化Tab.8 Changes in anabasine content of different types of tobacco during storage

2.2.4 贮藏过程中新烟草碱含量的变化

从不同类型烟草经自然贮藏后新烟草碱含量变化（图9和表9）可看出，晒烟A、白肋烟B新烟草碱含量差异不显著。白肋烟C含量显著低于白肋烟B，烤烟中新烟草碱含量最低。从下降程度来看，烤烟D较贮藏前降低34.95%。其次是白肋烟C，下降率为32.41%，晒烟A下降率为14.72%。白肋烟B下降程度最小。新烟草碱含量变化经拟合二次曲线模型相关系数均达到0.83以上，全部呈现极显著相关状态。

图9 不同类型烟草贮藏过程中新烟草碱含量的变化Fig.9 Changes in anatabine content of different types of tobacco during storage

表9 不同类型烟草贮藏过程中新烟草碱含量的变化Tab.9 Changes in anatabine content of different types of tobacco during storage

2.2.5 贮藏过程中生物碱总量的变化

从不同类型烟草在自然贮藏条件下生物碱总量变化（图10和表10）中可以看出，三种类型烟叶生物碱总量均有所下降。白肋烟B和晒烟A的生物碱总量显著高于其他两地区烟叶，其中白肋烟B生物碱总量最高，白肋烟C居第三.白肋烟和晒烟的生物碱总量显著高于烤烟，烤烟E高于烤烟D。白肋烟C下降27.91%，幅度最大。白肋烟B下降18.97%，两种烤烟分别降低了20.68%和19.68%。

图10 不同类型烟草贮藏过程中生物碱总量的变化Fig.10 Changes in total alkaloid content of different types of tobacco during storage

表10 不同类型烟草贮藏过程中生物碱总量的变化Tab.10 Changes in total alkaloid content of different types of tobacco during storage

2.3 烟草贮藏过程中硝酸盐含量的变化

从不同类型烟草五年自然贮藏期间硝酸盐含量变化（图11和表11）可看出，随时间增加，白肋烟和晾晒烟硝酸盐含量逐渐降低，烤烟不明显。晒烟A下降最多，降低56.15%，其次为白肋烟C和B，分别降低31.98%、30.26%。从图中可看出白肋烟硝酸盐含量高于晒烟，两者均显著高于烤烟，其中白肋烟B硝酸盐含量为烤烟的145.92倍，白肋烟C为烤烟的72.74倍。同种类型烟叶中，白肋烟B硝酸盐含量较白肋烟C高出100.54%。硝酸盐含量一元二次模型的相关系数均为0.84以上，拟合程度较高。

图11 不同类型烟草贮藏过程中NO3-N含量的变化Fig.11 Changes in NO3-N content of different types of tobacco during storage

表11 不同类型烟草贮藏过程中NO3-N含量的变化Tab.11 Changes in NO3-N content of different types of tobacco during storage

2.4 烟草贮藏过程中TSNAs的含量和变化量与生物碱、硝酸盐的相关关系

将贮藏前后TSNAs的含量和变化量与生物碱、硝酸盐贮藏前和减少量进行相关性分析得出表12，可看出，贮藏前四种TSNAs含量和生物碱相关性较大,在贮藏后有所下降，如NNN和降烟碱，NNK和烟碱以及NAB和假木贼碱的相关系数均较贮藏前有所减小，而与硝酸盐相关关系有相反趋势。NNN贮藏前后含量与降烟碱、硝酸盐含量关系密切，贮藏过程中增加量与降烟碱贮藏前、贮藏期间减少量之间有极显著相关关系，该结果与TSNAs总量和降烟碱、硝酸盐各项指标之间的相关关系相似。NNK增加量与烟碱等贮藏前含量、减少量之间相关关系显著。NAB含量上升情况与生物碱尤其是假木贼碱和总生物碱减少量相关关系显著。NAT的增加量与新烟草碱、硝酸盐贮藏前含量、减少量之间相关关系多为极显著。

表12 烟草贮藏过程中TSNAs的含量以及变化量和生物碱、硝酸盐的相关关系Tab.12 Relationship between the change in TSNAs and alkaloid and nitrate during storage

续表12

3 讨论

调制后的贮藏阶段是白肋烟和晒烟TSNAs形成的重要时期。相关分析表明，TSNAs的增加量与贮藏前较高的生物碱、硝酸盐含量密不可分，其中NNN与降烟碱， NNK与烟碱，NAB与假木贼碱，NAT与新烟草碱，总TSNAs与总生物碱，TSNAs与硝酸盐的关系密切。进一步分析发现，贮藏前后TSNA含量与生物碱、硝态氮含量相关性大小变化规律表明烟叶贮藏过程中TSNA的形成与硝态氮关系更为密切，降低烟叶硝态氮含量对于减少贮藏过程中TSNAs形成更为重要。烟叶贮藏过程中TSNAs的增加伴随着生物碱和硝态氮含量的下降，表明烟叶贮藏过程中TSNAs生物合成十分活跃。我们前期研究发现，贮藏环境对TSNAs形成影响很大，高温低湿可使烟叶硝态氮产生气态氮氧化物，其与生物碱结合生成TSNAs[22-23]，夏季温度较高，提供了高温条件，促进了TSNAs的生成。由于本研究所采用的不同烟叶类型样品硝态氮含量差异较大造成不同类型烟叶TSNAs变化幅度不同[24-26]，孙榅淑等人研究表明，白肋烟的硝态氮含量是烤烟的数十到数百倍[27]。关于不同类型烟草硝态氮含量差异的原因可能与不同基因型氮效率差异和栽培方式不同有关，研究得出，白肋烟氮效率低，最适施氮量达到了12.5-15kg/667m2[28],烤烟最适施氮量为2.5-3.5kg/667m2[29]，晒烟介于两者之间。白肋烟吸收氮较多，而光合速率弱，光合产物少，因此被同化的氮素较少，多余氮未被利用以硝态氮形式储存。四川和云南白肋烟TSNAs的差异可能是两地烟叶种植的品种烟碱转化率不同所致，四川宣汉达白1号平均烟碱转化率为14.30%，较云南宾川TN86的4.25%高出3.36倍[18]，因此选择合适的主栽品种、在大田生育期通过合理措施提高烟叶的光合性能以适当降低施肥量、不同类型烟草在贮藏过程中合理降温控湿都可以在一定程度上降低TSNAs含量，提高烟叶的安全性。

4 结论

在5年自然贮藏过程中，白肋烟、晒烟和烤烟中TSNA含量不断升高，符合二次曲线增长模型。白肋烟TSNAs尤其是NNN的含量最高，产生量最大，其次是晒烟，烤烟的TSNAs含量相对较低且在贮藏过程中增加幅度较小。生物碱和硝态氮含量在贮藏过程中与TSNAs呈相反变化趋势，其中生物碱含量与贮藏前TSNAs含量相关性大于贮藏后TSNAs含量，而硝态氮含量与贮藏后TSNAs含量相关性更大，降低烟叶硝态氮含量是减少贮藏过程中TSNAs形成的有效途径。

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