中药复方“脊髓康”对神经干细胞分化作用的影响＊

苑文超，王 磊，马 勇,2＊＊，黄桂成，郭 杨，

潘娅岚1，杨博元1，董晤训1，宗永刚2

（1.南南京中医药大学骨伤修复与重建新技术实验室 南京 210023；2.扬州大学江苏省中西医结合老年病防治重点实验 扬州 225002）

脊髓损伤(Spinal Cord Injury，SCI)是由汽车事故、跌倒、运动和暴力等高能量损伤引起的疾病[1]。严重的SCI会损伤神经组织，导致神经功能的突然丧失。据流行病学显示，我国SCI的发病率呈逐年上升趋势，且多发于中青年[2,3]，SCI的发生不但给患者身体和精神状态带来了极大的影响，而且给家庭和社会带来巨大的经济负担[4]。脊髓损伤后自身神经元大量丢失，且一旦损伤难以修复，因此成为骨科及神经科学领域的研究热点和难点。NSCs是能够实现自我更新、增殖和分化的神经母体细胞，具有产生神经元和胶质细胞的多向分化潜能，在治疗SCI方面具有巨大的应用前景。但研究表明[5]，经移植的NSCs在生理状态下，大部分分化为神经胶质细胞，产生神经元的几率较低，从而阻碍SCI部位的恢复。中药复方“脊髓康”为临床验方，用于脊髓损伤患者的治疗，疗效确切[6]。前期研究表明，JSK可促进大鼠SCI后神经功能的恢复、提升SCI后脊髓内脑源性神经营养因子蛋白及mRNA的表达水平[7]。鉴于此，课题组通过对JSK调控大鼠NSCs分化方向的研究，拟为NSCs移植治疗SCI提供新的研究思路和为中医药治疗SCI提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

清洁级SD孕鼠1只，孕期13-15天，体质量300-350 g；清洁级SD大鼠10只，雌雄均可，体质量250-300 g。均购自南京青龙山动物繁殖中心，动物生产许可证号：SCXK（苏）2012-0008。

1.1.2 药物及试剂

脊髓康（生黄芪30 g，当归12 g，丹参20 g，地鳖虫10 g，赤芍12 g，淫羊藿10 g，蜈蚣1条等）为我们临床经验方（国家发明专利ZL200910026193.7）（鉴定人：马勇；工作单位：南京中医药大学；职称：教授），其生药由南京中医药大学附属医院药剂科提供。DMEM/F12（1:1）培养基、B-27（无血清添加剂）、多聚赖氨酸（PLL）、谷氨酰胺（Glutamin）、FBS、HBSS溶液均购自美国Gibco公司;碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、表 皮 生 长 因 子（epidermal growth factor，EGF）均购于美国 PeproTech公司；二脒基苯基吲哚（4′6-diamidino-2-phenylindole,dihydrochloride，Dapi），购于Sigma公司，大鼠抗Nestin抗体、GFAP抗体、βⅢ-Tubulin抗体均购于美国CST公司，二抗Alexa488、Alexa 594均购于Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 含药血清的制备

“脊髓康”原方，加10倍水量，常法煎煮，滤液浓缩至2 g·mL-1，4℃保存备用。含药血清组以生药量20 g·kg-1灌胃，连续给药3天。末次给药后1 h经乙醚呼吸麻醉，腹动脉采血，每只大鼠采血5 mL,室温静置2 h[8]，3000 r·min-1离心6 min，分离血清，0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌，分装，-40℃保存备用。按照上述方法另取空白血清5 mL以稀释含药血清浓度。

1.2.2 原代NSCs的分离、培养以及鉴定1.2.2.1 原代NSCs的分离、培养

取孕期13-15天SD大鼠，2.5%戊巴比妥钠麻醉，剖腹取出胎鼠，迅速置于冰上；75%乙醇浸泡消毒后，完整取出大脑及脑干；体式显微镜下，暴露海马体，剥离血管膜，剪碎海马体至1-2 mm3大小，暂存于0℃HBSS溶液中；用5 mL注射器缓慢吹打形成细胞悬液；400目滤网过滤，收集悬液；1000 rpm离心5 min，移去上清，以无血清培养基重悬；计数后，以106·mL-1密度接种于培养瓶中，37℃、5%CO2培养箱培养；24 h后全量换液，首次换液后每3天半量换液。约7-8天后形成神经球，以机械吹打法进行传代。

1.2.2.2 原代NSCs鉴定

将部分神经球或消化后的单个细胞接种到PLL(浓度为0.1 mg/mL)处理的盖玻片上，继续培养15 min（神经球）或过夜（单个细胞），4%多聚甲醛固定15 min后，PBS润洗（5 min×3），0.2%Triton×-100室温处理15 min，PBS润洗（5 min×3），1%BSA常温封闭1 h，PBS润洗（5 min×3）加入鼠抗Nestin一抗，4℃过夜。次日，PBS润洗（5 min×3），加入FITC标记山羊抗兔二抗，常温孵育2 h，PBS润洗（5 min×3），DAPI标记细胞核，室温5 min，PBS润洗（5 min×3），封片、拍照。

1.2.2.3 NSCs分化后行免疫化学染色

将NSCs接种于经PLL处理过的24孔培养板中，每孔约接种40个神经球，加入500 μL 10%FBS完全培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中，2-3天后全量换液，7天后行βIII-Tubulin、GFAP免疫荧光染色，Alexa 594标记神经元骨架，Alexa 488标记星形胶质细胞相关膜蛋白，免疫荧光显微镜下观察、拍照。

1.2.3 “脊髓康”含药血清干预NSCs的分化情况1.2.3.1 实验分组

10%FBS诱导分化后，每孔分别加入10%、5%、2.5%的脊髓康含药血清，即JSK高、中、低剂量组（JSKH、JSK-M、JSK-L），2.5%、5%含药血清组用空白血清稀释，临用前将各组血清加入培养液中，并使培养液中含药血清终浓度为10%，同时设置不加含药血清（Blank）组（对照组），每组分别重复3次以确保稳定性。

1.2.3.2βⅢ-Tubulin、GFAP免疫荧光染色

（1）不同视野下计算βⅢ-Tubulin、GFAP细胞百分比

待以上两组NSCs贴壁分化7天后，分别行βⅢ-Tubulin、GFAP免疫荧光染色，荧光显微镜下观察、拍照。每组各取30个视野，分别计算出βⅢ-Tubulin、GFAP阳性细胞数占细胞总数的百分比，进行统计分析。

（2）不同视野下对βⅢ-Tubulin、GFAP细胞荧光定量

应用Image-Pro Plus软件对各组βⅢ-Tubulin、GFAP阳性细胞进行Area（Area of interest）、累计光密度（IOD）定量，并计算Area（红光）/Area（绿光）、IOD（红光）/IOD（绿光）的百分比，进行统计分析。

1.2.4 统计学处理

用SPSS19.0统计软件对数据进行处理，实验所得数据以±s表示，采用单因素方差分析进行统计学处理。P＜0.05具显著性差异。

2 结果

2.1 原代NSCs培养

原代分离的NSCs，悬浮于无血清培养基中，3-4天后单细胞逐渐形成、大小不一的细胞团，待7-8天后，细胞团逐渐生长成神经球形，如图1所示。

2.2 原代NSCs的鉴定

将生长状态良好的第4代NSCs行免疫化学染色，行Dapi、Nestin双标，如图2所示。

2.3 在“脊髓康”作用下，NSCs的分化情况

NSCs经JSK-H、JSK-M、JSK-L含药血清干预分化7天后，行βⅢ-Tubulin、GFAP免疫荧光双标，如图3所示。

2.4 βIII-Tubulin、GFAP的阳性细胞表达的百分比比较

如表1所示，JSK-H、JSK-M、JSK-L与Blank比较βIII-Tubulin百分比明显增高（P＜0.05），JSK-H与JSKM、JSK-L比较均有统计学意义（P＜0.01）；JSK-H、JSKM、JSK-L与Blank比较GFAP百分比明显降低（P＜0.05），JSK-H与JSK-M、JSK-L、比较均有统计学意义（P＜0.01）。

2.5 βIII-Tubulin、GFAP的阳性细胞表达荧光定量百分比比较

图1 a、b、c分别是NSCs在100、200、400倍显微镜下的生长状态

图2 a：NSCs形成神经球后的鉴定；b：NSCs神经球贴壁24 h后的鉴定。

JSK-H、JSK-M、JSK-L与Blank相比有显著差异（P＜0.05）；JSK-H与JSK-M、JSK-L均有显著差异（P＜0.01）。

图3 A、B、C、D分别为脊髓康含药血清高、中、低剂量组和空白组。

表1 βIII-tubulin、GFAP阳性细胞百分比比较

3 讨论

NSCs是一类具有分裂潜能和实现自我更新能力的母细胞，可以通过不对等的分裂方式产生神经组织的各类细胞。通过移植的方式将NSCs植入宿主体内，不但能够向神经系统的病变部位迁移、趋化，而且能够存活、增殖，分化为神经元和胶质细胞，进而促进损伤部位功能的部分恢复。目前，NSCs移植技术业已应用于脑梗塞、脑中风、脊髓损伤等疾病的治疗当中，并取得了一定进展[12]。

神经元是构成神经系统结构和功能的基本单位，通过诱导的方法促进神经干细胞向神经元分化，有利于神经受损后神经功能的恢复[13]。然而，在实验过程中，我们发现，诱导NSCs分化后，其形成的大量的胶质细胞，以星形胶质细胞为主，而神经元细胞却很少。在细胞的培养过程中，星形胶质细胞迅速生长，导致神经元细胞生长缓慢，甚至停止生长，最后大量死亡，给后期的NSCs体内回输实验带来了诸多困难。如何有效的抑制胶质细胞增殖，促进神经元细胞的生长俨然已是亟待解决的问题。脊髓损伤后，神经功能的恢复主要依赖于神经元对神经通路的重建，但是神经胶质细胞的大量产生会阻碍神经通路的形成，并且导致脊髓受损部位瘢痕的产生[14]。因此，通过调控因素抑制星形胶质细胞增殖、定向诱导NSCs分化为神经元细胞并促进其生长，对于SCI的治疗意义重大。

图4 βIII-Tubulin、GFAP的阳性细胞表达荧光定量百分比

JSK是我们结合多年临床实践经验，筛选出具有“祛瘀通督，温肾利湿，调和气血”功效的中药复方。以大补元气之生黄芪为君药；配以理气之枳实，补血之当归，清热凉血之赤芍加强调和气血之力；又配以活血化瘀之川芎、丹参，攻下逐瘀之大黄祛瘀生新；更加搜经剔络之水蛭、蜈蚣和地鳖虫等虫类药通督。诸药配合，共奏“袪瘀通督”之功效。以温补肾阳之肉苁蓉、仙灵脾、益智仁治肾之虚寒；在上之湿治以行气化湿之厚朴；在下之湿治以利水渗湿之泽泻、茯苓，车前子。诸药配合，共奏“温肾利湿”之功效。前期基础研究及临床研究均提示该方对SCI有着良好的功效，在改善脊髓微环境，促进SCI后患者神经功能的恢复方面疗效显著[15-17]。基于该方的良好疗效及神经元在SCI后发挥的重要作用，本实验即尝试探讨JSK治疗SCI是否与其促进NSCs分化为神经元的作用存有一定联系，实验结果（图3、4）显示，JSK能促进NSCs向神经元方向分化，且存在一定的量效关系。NSCs分化的调控机制主要与微环境、基因和信号通路三个方面有关[18]。“脊髓康”改善脊髓微环境的作用已经得到证实[15,19]，但其干预NSCs分化的分子机制尚不清楚，仍需进一步探索。

本实验仍存在的问题：1、在取原代NSCs时，为保证孕鼠的孕期的一致性，课题组采用观察未受孕大鼠的动情周期[20]的方法，虽达到了孕期一致的目的，但是浪费了大量时间和精力。目前，课题组也在寻求简便易行的方法；2、虽然JSK含药血清促进了NSCs向神经元分化，但是其具体的分子机制尚不清楚，这是课题组下一步研究的方向；3、人体是一个复杂的环境，如何模拟人体内部环境，进而保证NSCs分化后神经元细胞的存活的问题也是我们努力的方向。

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