自噬调控因子mTOR和Beclin1在良恶性多形性腺瘤中的表达及意义*

李 磊，李 冉，刘 江，刘 锐，杨国海，张艳波△

(1.承德医学院附属医院口腔科,河北承德 067000；2.华北理工大学组织学与胚胎学系,河北唐山 063000;

3.河北省唐山市工人医院口腔科 063000；4.华北理工大学解剖学系，河北唐山 063000)

论著·临床研究

自噬调控因子mTOR和Beclin1在良恶性多形性腺瘤中的表达及意义*

李 磊1，李 冉2，刘 江3，刘 锐1，杨国海4，张艳波1△

(1.承德医学院附属医院口腔科,河北承德 067000；2.华北理工大学组织学与胚胎学系,河北唐山 063000;

3.河北省唐山市工人医院口腔科 063000；4.华北理工大学解剖学系，河北唐山 063000)

目的研究自噬调控中的主要因子西罗莫司靶蛋白(mTOR)及Beclin1在良、恶性多形性腺瘤中的表达及意义。方法采用免疫组织化学显色检测Beclin1在35例腮腺瘤多形性腺瘤(CPA)，37例腮腺良性多形性腺瘤(PA)和20例正常腮腺组织中的表达情况。用蛋白免疫印迹法(Western blot)测定p-mTOR 、Beclin1在CPA、PA及正常腮腺组织中的表达情况。结果p-mTOR 在正常腮腺组织，PA，CPA中的阳性表达呈递增的趋势，三者间差异有统计学意义(P<0.05)；Beclin1在3种组织中表达呈递减趋势,三者间差异也有统计学意义(P<0.05)。结论mTOR信号因子在CPA组织中过度表达，而Beclin1在CPA组织中的阳性表达受到抑制。

自噬;他克莫司结合蛋白质类;Beclin 1；癌在多形性腺瘤

多形性腺瘤(pleomorphic adenoma，PA)又名混合瘤，多发生于腮腺，手术切除后常容易复发，生长一段时期后，突然加速生长，多为恶变。目前研究显示，肿瘤的发生常伴随着细胞自噬活性的改变，其调控机制及自噬通路相关蛋白在良、恶性肿瘤，如癌在多形性腺瘤(carcinoma in pleomorphic adenoma，CPA)中的作用尚不清楚，本课题将进一步研究自噬相关因子在良、恶性肿瘤中的作用。

西罗莫司靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)和Beclin1都有介导自噬发生的作用，并形成mTOR-Beclin1交互调控网络，调节自噬。有研究证明 PI3K-Akt/TSC1/2-mTOR 信号通路在肿瘤的生成生长中起重要作用，在肝癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌等均有报道[1-2]。本研究通过对PI3K/Akt-TSC1/2-mTOR信号通路相关蛋白磷酸化mTOR(p-mTOR)及自噬相关蛋白Beclin1表达的检测，分析其与腮腺良、恶性肿瘤的关系。

1 资料与方法

1.1材料与试剂 所用组织来源于唐山市工人医院和承德附属医院口腔外科手术病理组织，其中CPA组织35例， 腮腺组织37 例，正常腮腺组织20例。所有手术标本有2名医师进行病理验证，且患者术前未进行放疗、化疗等治疗。p-mTOR、Beclin 1单克隆抗体均购自Santa Cruz公司。

1.2免疫组织化学检测 石蜡切片按常规脱蜡置水，3%过氧化氢孵育10 min(室温下)，清洗后加正常山羊血清于切片封闭，室温孵育10 min滴加1∶400一抗工作液，37 ℃ 孵育 1～2 h，切片加生物素标记的二抗工作液，室温孵育15～30 min后滴加适量辣根过氧化物酶工作液孵育。切片滴加DAB显色，组织细胞着棕黄色后终止反应，以苏木素复染、分色，切片脱水透明后封片。阴性对照组不加一抗以PBS替代。

1.3Western blot法半定量分析Beclin1、p-mTOR表达情况 4 ℃预冷的细胞裂解液裂解保存的组织，冰浴中用匀浆器将组织匀浆， 4 ℃ 30 min后提取上清液，以微孔酶标仪法进行蛋白定量，样品处理后加样，转膜并加抗靶蛋白的特异性一抗，以牛血清清蛋白(BSA)溶液稀释，其中Beclin1稀释比例1∶500，p-mTOR稀释比例1∶1 000，加针对一抗的碱性磷酸酶偶联二抗于室温下孵育，经自动图像分析系统半定量分析实验结果。应用Image J医学图像分析系统在同一条件下测定目标条带整合光密度值，计算出各组样品目标条带与内参(β-actin)比值大小作为分析对象进行比较。

A:正常腮腺;B:PA;C:CPA

图1 Beclin1在各组织中的表达(免疫组织化学×400)

1.4免疫组织化学结果评价 将细胞质内染色为棕黄色颗粒标记为阳性细胞。由2名病理科医师观察10个高倍视野，采用双盲法阅片，以每个视野100个细胞计数，以阳性细胞率和阳性细胞染色深度进行细胞阳性率评定。阳性细胞率：1分，阳性细胞数比率占细胞总数小于10%；2分，阳性细胞数占细胞总数10%～50%；3分，阳性细胞数占细胞总数大于50%。染色深度：0分为无染色标记；1分为淡黄色标记，2分为黄色标记，3分为棕黄色标记。2项评分相乘即为总评分，阴性0～3分，阳性4分及以上。结果定量：免疫组织化学阳性分析经自动图像分析系统进行半定量。

2 结 果

2.1Beclin1在正常、PA、CPA腮腺组织中的表达 Beclin1在正常、PA、CPA腮腺组织中的阳性率分别为100%、89%、56%(图1)，三者间差异有统计学意义(P<0.05)。

A：Western blot；B：Western blot分析图；a:P<0.05比较，与正常腮腺组织;b:P<0.05，与PA组腮腺组织比较

图2 p-mTOR在正常、PA和

CPA腮腺组织中的表达

2.2Western blot法检测p-mTOR、Beclin1在各组织中的表达结果 p-mTOR在3种腮腺组织中均有表达，其表达量在正常、PA、CPA腮腺组织中呈递增趋势，三者之间差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。Beclin1在正常、PA、CPA、腮腺组织中的表达呈递减趋势，三者之间差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

A：Western blot；B：Westerh blot分析图；a:P<0.05，与正常腮腺组织比较;b:P<0.05，与PA比较

图3 Beclin1在正常、PA和CPA腮腺组织中的表达

3 讨 论

自噬是真核细胞特有的生命现象，是亚细胞水平变化的一种进化保守的细胞功能。在多种肿瘤的发生发展过程中都存在细胞自噬及信号转导的改变。本课题组前期研究显示，自噬相关蛋白LC3在腮腺PA及CPA中表达下调，提示自噬功能改变可能在腮腺肿瘤形成中具有一定作用[3]。mTOR和Beclin1是自噬调控的重要因子，在Beclin1调节自噬的网络功能中mTOR细胞信号传导通道的作用及之间存在的相互反馈调控机制的研究也是当今热点问题之一[4]。

mTOR属于磷脂酰肌醇激酶相关激酶蛋白家族成员，是细胞调节的主要激酶。调控着大量促进细胞周期进程的蛋白质的翻译，异常的mTOR活性与大量的人类癌症有着密切的关系。mTOR在自噬的发生发展过程中起到重要调控作用，是自噬调控通路上的关键位点。mTOR作为下游信号分子，可以直接被AKT激活，也可以通过抑制TSC来激活。Johnson等[5]在对直结肠癌的分析研究中显示p-mTOR的表达明显高于正常黏膜组织。Guo等[6]对患有肾囊腺瘤的小鼠使用西罗莫司进行治疗，4周后测量肿瘤体积显著减小，同时发现mTOR的表达量下降，这显示mTOR在肾囊腺瘤的发展中起到了重要的作用。本试验探讨了mTOR信号通路在腮腺CPA、正常腮腺组织、良性PA中的表达情况，发现p-mTOR在大部分腮腺PA中呈过度表达。p-mTOR在正常腮腺组织、良性PA、CPA中的阳性表达呈递增趋势，差异有统计学意义(P<0.05)。提示mTOR信号通路在腮腺CPA组织中表达异常，可能在腮腺CPA的发生、发展中起到了重要的作用。

Beclin1基因是人们在研究致死Sinbis病毒性脑炎大鼠过程中，在其中分离出的一个与肿瘤抑制相关的基因[7]，Beclin1蛋白由4个结构域构成：卷曲螺旋结构域、BH3、进化保守结构域和核输出结构域[8]，通过这些结构域形成复合体定位于自噬体膜上从而介导自噬，诱导细胞凋亡。Beclin1复合体与含有BH3结构域的Bcl-2结合后可改变细胞自噬进程，并且Beclin1与Bcl-2的作用受环境影响较大，当环境养分减少时自噬基因Beclin1和Bcl-2之间的相互作用显著减少。研究发现在子宫颈癌[9]、结肠癌、卵巢癌[10]等多种肿瘤中都发现表达异常的Beclin1蛋白。本试验用Western blot法测定Beclin1在35例CPA、37例PA和20例正常腮腺组织中的表达情况，结果显示在正常腮腺组织Beclin1有较高水平表达，在PA中表达较低，在CPA中表达最低，差异有统计学意义(P<0.05)。提示Beclin1的表达降低可能与CPA的形成及病理进程密切相关，可作为判断恶性多形性腺瘤的预后的辅助指标，同时有望成为其生物治疗的新靶点。

自噬调控因子mTOR和Beclin1是介导调控自噬的重要因子，在细胞自噬中扮演重要角色，其在肿瘤中的表达异常可能在肿瘤的发生、发展中具有重要意义，其分子学机制还有待进一步研究。

[1]Huang GM,Jiang QH,Cai C,et al.SCD1 negatively regulates autophagy-induced cell death in human hepatocellular carcinoma through inactivation of the AMPK signaling pathway[J].Cancer Lett,2015,358(2)；180-190.

[2]Prasad R,Vaid M,Katiyar SK,et al.Grape proanthocyanidin inhibit pancreatic cancer cell growth in vitro and in vivo through induction of apoptosis and by targeting the PI3K/Akt pathway[J].PLoS One,2012,7(8):e43064.

[3]李冉，李磊，刘江，等.Beclin 1 与LC3 蛋白在腮腺多形性腺瘤及腮腺癌在多形性腺瘤中的表达和意义[J].第三军医大学学报，2012,34(13)：1293-1295.

[4]Kang R,Zeh HJ,Lotze MT,et al.The Beclin 1 network regulates autophagy and apoptosis [J].Cell Death Differ,2011,18(4)：571-580.

[5]Johnson SM,Gulhati P,Rampy BA,et al.Novel expression patterns of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway components in colorectal cancer[J].J Am Coll Surg,2010,210(5):767-778.

[6]Guo Y,Kwiatkowski DJ.Equivalent benefit of rapamycin and a potent m TOR ATP-competitive inhibitor,MLN0128(INK128),in a mouse model of tuberous sclerosis[J].Mol Cancer Res,2013,11(5)：467-473.

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[10]Miracco C,Cosci E,Oliveri G,et al.Protein and mRNA expression of autophagy gene Beclin-1 in human brain tumours [J].Int J Col,2007,30(2)：429-436.

ExpressionandsignificanceofautophagicregulatoryfactormTORandBeclin1inbenignandmalignantpleomorphicadenoma*

LiLei1,LiRan2,LiuJiang3,LiuRui1,YangGuohai4，ZhangYanbo1△

(1.DepartmentofStomatology,AffiliatedStomatologyHospitalofChengdeMedicalCollege,Chengde,Hebei067000,China2.FacultyofHistologyandEmbryology，NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan,Hebei063000,China；3.DepartmentofStomatology，Workers′HospitalofTangshanCity,Hebei067000,China；4.FacultyofAnatomy,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan,Hebei063000,China)

ObjectiveTo explore the expression and significance of main autophagic regulatory factors of mTOR and Beclin1 in benign and malignant pleomorphic adenoma.MethodsThe expression of Beclin1 in 35 cases of carcinoma in parotid pleomorphic adenoma(CPA),37 cases of benign pleomorphic adenoma(PA) and 20 cases and normal parotid tissues was measured by adopting the immunohistochemical staining method.The expression of p-mTOR and Beclin1 in CPA,PA and normal parotid tissues was measured by Western blot.ResultsThe positive expression of p-mTOR in normal parotid tissue,parotid pleomorphic adenoma and parotid pleomorphic adenoma showed the increasing trend,and the difference among them was statistically significant(P<0.05).The Beclin1 level in 3 kinds of tissue showed the descending trend,the difference among the three tissues was statistically significant(P<0.05).ConclusionmTOR signal factor is over-expressed in CPA tissue,while the positive expression of Beclin 1 is inhibited in CPA tissue.

] autophagy;tacrolimus binding proteins;Beclin 1;carcinoma in pleomorphic adenoma

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.36.015

河北省重点科技研究计划(20130338，20150079)；河北省自然科学基金资助项目(H2014105079)。

李磊(1978-)，副主任医师，硕士，主要从事口腔临床研究。△

，E-mail:13831476354@163.com。

R739.87

A

1671-8348(2017)36-5083-03

2017-08-09

2017-09-11)