微孔板试剂盒法测定婴幼儿配方奶粉中的生物素含量

周 敏，许再元，苏水娇，彭密军

(广东省测试分析研究所(中国广州分析测试中心)，广东 广州 510070)

微孔板试剂盒法测定婴幼儿配方奶粉中的生物素含量

周 敏，许再元，苏水娇，彭密军*

(广东省测试分析研究所(中国广州分析测试中心)，广东 广州 510070)

基于植物乳杆菌(ATCC 8014)生长时的新陈代谢强度与生物素浓度的关系，定量测定婴幼儿配方奶粉中的生物素含量。将稀释了的提取物和生物素检测培养基加至包被有植物乳杆菌的微孔中，植物乳杆菌生长量与生物素浓度形成关系并可以绘制成多项式拟合曲线，根据培养后菌悬液的吸光度值与生物素标准工作曲线进行比较，计算出婴幼儿配方奶粉中的生物素含量。微孔板试剂盒法测定生物素的线性范围为0.080～0.720 μg·100 g-1，其标准曲线相关系数为0.998 9，测定婴幼儿配方奶粉中的生物素含量的相对标准偏差为2.5%，加标实验回收率为91.2%～99.3%。结果表明，微孔板试剂盒法具有快速、简便、准确度和重现性良好等优点，是测定婴幼儿配方奶粉中生物素的有效方法。

微孔板试剂盒法； 生物素；婴幼儿配方奶粉； 植物乳杆菌

生物素(Biotin)又称维生素H、辅酶R、维生素B7，是一种水溶性B族维生素。生物素是合成维生素C的必要物质，是一种维持人体自然生长、发育和正常人体机能健康必要的营养素，对脂肪和蛋白质正常代谢起到至关重要的作用，在脂肪合成、糖质新生等生化反应途径中扮演重要角色。生物素主要来源于酵母、花椰菜、坚果类、蛋黄、肝脏和肾脏。人体肠道细菌可合成一些生物素，人体极少缺乏。但研究表明，由于婴儿肠道功能较弱，导致缺乏生物素而易患舌炎和皮炎，有可能造成严重的神经症状，出现躁狂、嗜睡和发育迟缓，并可引起猝死综合症，因此生物素常作为一种营养补充剂而被广泛添加到婴幼儿食品中[1]。

有关文献报道的常用于生物素的经典检测方法有微生物法[2-3]、分光光度法[4]、酶联免疫法[5-6]、高效液相色谱法[7-9]和超高效液相色谱-质谱联用法等[10-11]。分光光度法灵敏度差，基质干扰较大，只适用于基质简单，生物素含量高的样品。酶联免疫法干扰因素较多，重复性不好。高效液相色谱法对成分复杂、色素较多、杂质干扰大的样品分离效果不好。而超高效液相色谱-质谱联用法成本高，且操作起来费时费力，样品前处理十分烦琐。微生物法是最为灵敏和应用最为广泛的方法，主要用于生物素的微量检测。本文采用德国拜发生物素试剂盒对婴幼儿配方奶粉中的生物含量进行检测，利用植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)对生物素的灵敏性和特异性，定量测定出试样中待测物质的含量。通过植物乳杆菌的生长量来测定婴幼儿配方奶粉中生物素的含量，并从方法线性、精密度和回收率等方面研究该方法的重现性、稳定性和可靠性。微孔板试剂盒法避免了大量玻璃器皿的使用，减少了对试验微生物生长带来抑制或促进的各类因子，显著降低了外部因素的干扰。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

德国拜发生物素试剂盒，包括1×96孔微孔板，包被有植物乳杆菌Lactobacillusplantarum，3×30 mL无菌蒸馏水(准备培养基，标准品和样品提取稀释液)，3×生物素培养基(固体)，3×生物素标准品(固体)，3×粘合箔，1×微孔板框。生物素标准品(99.6%)国产，中国食品药品检定研究院。

生物安全柜，微孔板酶标仪，生化培养箱，95 ℃水浴锅，pH计，离心机，无菌离心管，无菌微量移液器，无菌注射器，0.2 μm无菌滤膜。

1.2 生物素储备液的配制

生物素标准储备液(112.6 μg·mL-1)：称取112.6 mg生物素标准品，用50%乙醇溶液溶解并转移至1 000 mL容量瓶中，定容至刻度。储存于棕色瓶中，于2～4 ℃冰箱保存12个月。

生物素标准工作液(1.126 μg·mL-1)：准确吸取1.00 mL生物素标准储备液置于100 mL棕色容量瓶中，用50%乙醇溶液稀释并定容至刻度。混匀后储存于瓶中，于2～4 ℃冰箱保存6个月。

1.3 样品前处理

根据样品中生物素的含量确定稀释倍数，确保样品提取液稀释后落在标准曲线范围内。称取1.0 g(精确至0.1 mg)至一个50 mL离心管中，加入约30 mL蒸馏水，摇匀，用HCl或NaOH调pH至8.0±0.2，摇匀，加蒸馏水至40 mL。95 ℃水浴30 min，其间振荡至少5次，确保离心管紧闭，并迅速冷却到30 ℃以下，并用0.2 μm无菌滤膜过滤至1.5 mL或2.0 mL无菌离心管中，并再对样品滤液进行稀释备用。

1.4 标准曲线工作溶液的制备

将试剂盒中生物素标准品瓶签上标注的规定量无菌水(取自试剂盒)加入标准品瓶中，盖上标准品瓶盖，摇匀稀释得到标准品浓缩液。取18个2.0 mL无菌离心管，准备标准品溶液。

1.5 生物素培养基的配制

加入10 mL无菌水(取自试剂盒)至生物素培养基瓶中，盖好培养基瓶，摇匀。95 ℃水浴加热5 min，其间振荡至少2次，并确保瓶子封闭，并迅速冷却到30 ℃以下，并用0.2 μm无菌滤膜过滤至15 mL无菌离心管中。

1.6 加样和培养

微孔板试剂盒法中必须使用无菌水稀释的无菌样品，无菌水取自试剂盒，取出需要数量的微孔板条并在板上固定，首先用无菌微量移液器移取150 μL生物素培养基至微孔中，然后移取150 μL标准品或稀释的样品至指定的微孔中，重复3次。最后，去除黏合箔上的保护层，将其平放在微孔条上，用手将粘合箔平压，使其充分封闭微孔板条。将微孔板至于37 ℃黑暗条件下孵育44～48 h。

1.7 生物素含量的测定及计算

培养结束后，再次向下挤压粘合箔，将微孔板向上放置在桌面上，平面振荡，使菌悬液均匀分布于微孔中，从微孔板右上角以对角线180°轻扯下粘合箔，与此同时另一只手按住放置在桌面上的微孔板，防止粘合箔与微孔板粘合过紧而在撕扯时带起微孔板。用无菌移液管尖破坏微孔中液体表面的所有泡沫。在630 nm条件下，用酶标仪读取菌悬液的浊度。婴幼儿配方奶粉中的生物素含量计算公式：

X=C×K÷M。

其中X为生物素含量，μg·100 g-1；C为标准曲线上读取的浓度，μg·100 g-1；K为稀释倍数；M为样品质量，g。

2 结果与分析

2.1 生物素标准工作曲线

计算结果时使用拜发公司提供的配套RIDA® SOFT Win 软件。当标准曲线空白的D值小于标准品1的D值，且标准品5的D值大于0.6时，判定检测结果有效，标准曲线图见图1。测得标准曲线回归系数为0.998 9。

图1 生物素的标准曲线

2.2 方法的重复性试验

用微生物法对同一婴幼儿配方奶粉测定了6次，生物素含量测定结果见表1。6次测定的平均值为28.96 μg·100 g-1，相对标准偏差为2.5%，说明该方法的重复性良好，试验结果可靠。

表1 生物素重复性试验的结果

2.3 方法的回收率试验

称取已知生物素含量的婴幼儿配方奶粉进行回收率试验，先对试验样品进行前处理，然后按表2精确地加入生物素的标准溶液，按照前述的方法进行培养后测定生物素的含量。由表2可见，该方法回收率为91.2%～99.3%，回收率稳定、准确度高。

表2 生物素加标回收试验的结果

3 小结

从试验结果可以看出，利用植物乳杆菌的生长测定婴幼儿配方奶粉中的生物素含量的微孔板试剂盒方法具有操作步骤简单、检测周期短、检出限低、结果准确与重现性高的优点。与传统国标方法相比，避免了大量玻璃器皿的使用，节省了人力物力；采用包被了植物乳杆菌的微孔板省去了接种液制备的步骤，极大地降低了菌种在传代、保存以及活化过程中发生突变、污染的可能性，菌株的活力更加稳定，保证了整个实验的可靠性和有效性；D值的读取时间一致，有利于减少系统误差，提高了实验数据的准确性。该方法测定婴幼儿配方奶粉中的生物素含量是有效可行的。

用微孔板试剂盒法测定生物素含量，有很多因素可能会对实验结果造成一定的影响。因此，整个实验对实验室和检验人员都有较高的要求，采用本方法需要注意以下试验要点：首先是整个实验过程一定要注意无菌操作，避免污染。生物素检测所用器皿均严格清洗干净并消毒灭菌，标准曲线的制备、样品的过滤除菌都要在无菌环境进行。其次，样品前处理以及生物素培养基水浴后的降温过程一定要迅速，避免产生有色物质，对酶标仪D值的读取造成误差，并且建议每个梯度的标准品以及不同稀释倍数的样品做3个平行对照，取平均值。样品稀释后的生物素浓度应在标准曲线的中间位置，并且多选几个稀释度，注意稀释液的均匀性以及微量稀释过程的准确性。再次，使用拜发公司提供的配套RIDA® SOFT Win 软件绘制标准曲线，由于微生物的生长是非线性的，采用四参数拟合更符合实验用菌株的实际生长状况，得出的样品中的生物素含量的数据更加精确。最后，应该保存每次试验样品测定的所有数据和信息，为以后的测定提供参考，从而提高工作效率，并且每次试验条件尽可能保持一致，以保证标准曲线的有效性和代表性以及试验的重复性和稳定性。

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2017-09-26

广东省科学院项目(2017GDASCX-0702)

周敏(1986—)，女，湖南长沙人，工程师，硕士，从事微生物检测及研究工作，E-mail:zhoumin07079999@163.com。

彭密军(1967—)，女，湖南湘潭人，教授，博士，从事天然产物的研发工作，E-mail:pengmj163@163.com。

文献著录格式：周敏，许再元，苏水娇，等. 微孔板试剂盒法测定婴幼儿配方奶粉中的生物素含量[J].浙江农业科学，2017，58(12)：2246-2248.

10.16178/j.issn.0528-9017.20171251

TS207.3

A

0528-9017(2017)12-2246-03

张 韵)