脱除赭曲霉毒素A的枯草芽孢杆菌CW14摇床培养条件优化

章雨馨，叶婉琼，孙正阳，梁志宏

(中国农业大学北京食品营养与人类健康高精尖创新中心 食品科学与营养工程学院，北京 100083)

脱除赭曲霉毒素A的枯草芽孢杆菌CW14摇床培养条件优化

章雨馨，叶婉琼，孙正阳，梁志宏*

(中国农业大学北京食品营养与人类健康高精尖创新中心 食品科学与营养工程学院，北京 100083)

以一株具有降解赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)能力的枯草芽孢杆菌BacillussubtilisCW14为材料，采用单因素试验和正交试验，对其发酵初始pH值、培养基配比、培养温度和转速等4个因素进行优化。试验结果表明，B.subtilisCW14摇床培养的最佳条件是：初始pH值为7.0，培养基胰蛋白胨与酵母浸粉配比为10∶5，发酵温度为37 ℃，转速为200 r·min-1。在此条件下培养，其菌体密度最大可达1.56×108cfu·mL-1，OTA脱除率达83.91%。

枯草芽孢杆菌； 单因素试验； 正交试验； 优化

真菌毒素是真菌在生长过程中所产生的一些次级代谢产物，广泛存在于谷物和饲料中，对人畜健康危害极大。常见的真菌毒素有黄曲霉毒素(aflotoxins)、赭曲霉毒素(Ochratoxins，OTs)、玉米赤霉烯酮(zearalenone)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol)、T-2毒素(trichothecenes)、伏马菌素(fumonisin)等。

赭曲霉毒素OTs是L-β-苯基丙氨酸与异香豆素的联合，有A、B、C、D 4种化合物，此外还有赭曲霉毒素A的一些代谢产物，如4-R-羟化赭曲霉毒素、4-S-羟化赭曲霉毒素、10-羟化赭曲霉毒素，以及赭曲霉毒素B的代谢产物赭曲霉毒素β等，都是结构类似的化合物。这些物质在化学结构上只有细微差异，但在毒理学方面却差别很大。其中，以赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)分布最普遍，毒性最强，并且最易检出[1]。OTA属于肾毒性真菌毒素，可导致人和动物的肾疾病。1993年国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer，IARC)将OTA定为“可能的人类致癌物”，即2B类致癌物。OTA被认为是巴尔干地方性肾炎与慢性间质性肾病这2种慢性疾病的病因，甚至会引发人类肾肿瘤[2]。此外，该毒素还具有肝毒性、致畸性，以及抑制免疫系统的毒性，其中致畸性具有物种选择性[3]。

近年来，国内外有关OTA脱毒的研究很多。有的研究OTA合成的影响因素，例如环境、营养基质等。有研究表明，精氨酸(Arg)能抑制OTA的生物合成[4]。但更多的研究集中于OTA的脱除。OTA的脱毒方法主要有化学脱毒、物理吸附和生物脱毒，且目前比较成熟的技术主要为化学脱毒和物理吸附。但化学脱毒和物理吸附因存在副作用、费用较高、影响食品的风味和营养等原因不利于推广应用。生物脱毒利用微生物作用去除毒素毒性，副作用小，环境友好，是一种较为理想的脱毒方法，现已成为世界各国竞相研究的热点。

芽孢杆菌(Bacillusspp.)具有对OTA的脱毒能力，但报道的菌株相对较少，而且脱毒能力不尽相同。有研究报道从新鲜的麋鹿粪便中分离到一株枯草芽孢杆菌CW14，对OTA有较强脱除效果[5]。我国农业部允许将枯草芽孢杆菌用作饲料添加剂，并重点应用于微生物制剂方面。本研究采用单因素试验和正交试验对功能菌株B.subtilisCW14摇床培养条件进行优化，获得脱毒菌株最优培养条件，为今后进一步研究此菌的脱毒机理以及工业发酵生产获得脱毒制剂提供材料和数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 供试菌种

从新鲜的麋鹿粪便中分离到的枯草芽孢杆菌CW14(B.subtilisCW14)，于本实验室鉴定与保藏。

1.1.2 培养基及试剂

LB培养基：酵母浸粉5.0 g·L-1，NaCl 10.0 g·L-1，胰蛋白胨10.0 g·L-1，pH 7.0。固体培养基加1.5%的琼脂，121 ℃灭菌20 min。

盐酸，分析纯；氢氧化钠，分析纯。

1.1.3 主要仪器设备

HZQ-X160全振荡培养箱，江苏太仓市实验设备厂；MLS-3750高压蒸汽灭菌锅，北京天林恒泰科技有限公司；超净工作台，北京半导体设备一厂；PHX型智能生化培养箱，宁波莱福科技有限公司；3001-1669全波长扫描酶标仪，Thermo Fisher Scientific Oy(芬兰)。

1.2 菌种活化

-80 ℃甘油保存的B.subtilisCW14，取1 mL接种到100 mL LB液体培养基中，置于恒温振荡培养箱，37 ℃，200 r·min-1培养24 h活化。

配制LB液体培养基与LB固体培养基，利用平板菌落计数法得到培养后的菌体浓度，同时测定样本的D600值，制得B.subtilisCW14菌液浓度与D600值的对应关系曲线。调整初始接种浓度达到106cfu·mL-1。

1.3 单因素试验

1.3.1 摇床发酵温度对菌体数量的影响

设置摇床发酵温度分别为32、37、42 ℃，在初始pH值7.0、装液量100 mL·250 mL-1、接种量1%、转速200 r·min-1条件下振荡培养24 h，每组设置2个重复，测定D600值。

1.3.2 摇床转速对菌体数量的影响

设置摇床转速分别为180、200、220 r·min-1，在初始pH值7.0、装液量100 mL·250 mL-1、接种量1%、温度37 ℃条件下振荡培养24 h，每组设置2个重复，测定D600值。

1.3.3 摇床初始pH值对菌体数量的影响

将LB培养基的初始pH值使用1 mol·L-1HCl或1 mol·L-1NaOH溶液分别调至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，121 ℃高压灭菌20 min后，在装液量100 mL·250 mL-1、接种量1%、转速200 r·min-1、温度37 ℃条件下振荡培养24 h，每组设置2个重复，测定D600值。

1.3.4 培养基成分配比对菌体数量的影响

配制胰蛋白胨与酵母浸粉配比分别为8∶7、9∶6、10∶5、11∶4、12∶3的液体培养基，121 ℃高压灭菌20 min后，在装液量100 mL·250 mL-1、接种量1%、转速200 r·min-1、温度37 ℃条件下振荡培养24 h，每组设置2个重复，测定D600值。

1.4 摇床培养条件的正交试验优化

在摇床单因素试验培养条件优化的基础上，适当缩小各个因素的范围，根据正交试验表L9(34)进行4因素3水平的正交试验，培养24 h。具体地：发酵温度(A)的3个水平分别为35 ℃(A1)、37 ℃(A2)、39 ℃(A3)，转速(B)的3个水平分别为180 r·min-1(B1)、200 r·min-1(B2)、220 r·min-1(B3)，初始pH值(C)的3个水平分别为6.5(C1)、7.0(C2)、7.5(C3)，培养基配比(胰蛋白胨与酵母浸粉配比，D)的3个水平分别为9∶6(D1)、10∶5(D2)、11∶4(D3)。每组试验设置3个重复，测定发酵培养液的D600值。

1.5 摇床培养优化条件下菌浓测定以及优化发酵液脱除OTA的研究

在最优培养条件下测定D600，并使用高效液相色谱(HPLC)对最优条件下OTA脱毒效果进行检测。具体地：三氯甲烷样用氮吹仪吹干(55 ℃)，加等量甲醇溶解，流动相为乙腈∶水∶乙酸(体积比)=100∶100∶1，流速1 mL·min-1，上样量20 μL(如果出现平峰，等倍稀释样品和对照)，检出限0.02 ng。

OTA降解率的计算：降解率=(1-对照峰面积/样品峰面积)×100。

1.6 统计分析

每组试验结果重复3次，采用SPSS 20.0进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 发酵温度对培养液菌体数量的影响

统计分析发现，37 ℃组与32 ℃、42 ℃组均表现出显著差异(P<0.05)，说明CW14菌株对温度比较敏感，最适温度区域较窄，温度过高或过低都会使细胞内蛋白质及酶的活性受到抑制。根据单因素试验结果(图1)，发酵温度以37 ℃为宜。

柱上无相同字母的表示处理间差异显著(P<0.05)。图2～4同图1 不同发酵温度对枯草芽孢杆菌CW14培养液菌体数量的影响

2.2 摇床转速对培养液菌体数量的影响

如图2所示：转速较低时，菌体数量随转速的增大而增大，当转速达到200 r·min-1时，菌体数量最大，之后随转速增大而略有减小。这是因为，低转速条件下，提高转速能增大培养基与氧气的接触面积，加快物质交换速率，延长细小气泡在发酵液中的滞留时间，提高供氧能力，从而加快菌体生长繁殖；而在较高转速条件下，溶氧系数降低，供氧能力降低，而且伴随明显的剪切力，促使菌体自溶，菌体数量降低[6]。考虑到生产工艺、能耗及高转速对设备磨损的影响等因素，CW14菌株的摇床转速以200 r·min-1为宜。

图2 不同摇床转速对枯草芽孢杆菌CW14培养液菌体数量的影响

2.3 摇床初始pH值对培养液菌体数量的影响

培养基pH值会通过影响细胞代谢相关酶活性和细胞中物质的离子化程度，进而影响微生物的生长代谢[7]。如图3所示：当pH≤7时，菌体数量随pH值的增大而增大，但处理间无显著差异；当pH>7时，菌体数量骤减，且显著(P<0.05)低于pH<7时各处理的菌体数量。pH=7时，菌体数量最大，而且无论是从菌体培养获得生物量的角度，还是从发酵获得代谢物，以及后期的分离纯化等角度考虑，中性条件都具有很好的操作优势；因此，CW14菌株培养时初始pH值宜选择为7。

图3 不同初始pH值对枯草芽孢杆菌CW14培养液菌体数量的影响

2.4 培养基成分配比对培养液菌体数量的影响

如图4所示，胰蛋白胨与酵母浸粉配比为9∶6与10∶5组的培养液菌体数量最大，显著(P<0.05)高于其他处理。总体来看，当酵母浸粉的比重过低时，会影响菌的生长。这是因为，酵母浸粉中含有丰富的氨基酸、水溶性维生素以及多糖，虽然胰蛋白胨中也含有部分氨基酸，但是缺乏半胱氨酸、甲硫氨酸等含硫氨基酸，因此胰蛋白胨与酵母浸粉需要配合使用，以二者配比10∶5效果最佳。

图4 不同培养基成分配比对枯草芽孢杆菌CW14培养液菌体数量的影响

2.5 摇床培养条件的正交试验优化

正交试验结果(表1)显示，各因子对菌体生长的影响依次为初始pH值(C)>培养基配比(D)>摇床转速(B)>发酵温度(A)。菌体生长的最佳培养条件组合是A2B2C2D2，即发酵温度37 ℃、摇床转速200 r·min-1、初始pH值7.0、培养基配比10∶5。试验显示，在此条件下培养，菌液D600达0.854，即菌体密度达1.56×108cfu·mL-1。对最优条件下OTA脱除效果进行检测，发现脱毒能力达到83.91%，证明经过培养条件优化后的枯草芽孢杆菌对OTA依然保有很强的脱除活性。

表1 正交试验设计及结果分析

3 小结与讨论

CW14是一株具有脱除OTA能力的功能菌株。本研究将其作为试验材料，对影响其生长的因素进行探索，正交试验结果显示，CW14的最佳摇床培养条件为：温度37 ℃，转速200 r·min-1，培养液初始pH值7.0，胰蛋白胨与酵母浸粉配比10∶5。各因子对菌体生长影响的权重依次为初始pH值>培养基配比>转速>发酵温度。在后期的应用研究或发酵罐扩大培养阶段，应优先关注培养液初始pH值的调整。

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2017-09-19

中央高校基本科研业务费专项资金(2015SP005)

章雨馨(1996—)，女，安徽黄山人，本科生，研究方向为食品微生物，E-mail：zhangyuxin@cau.edu.cn。

梁志宏(1969—)，女，内蒙古呼和浩特人，副教授，博士，从事微生物与食品安全方面的研究工作，E-mail：lzh105@cau.edu.cn。

文献著录格式：章雨馨，叶婉琼，孙正阳，等. 脱除赭曲霉毒素A的枯草芽孢杆菌CW14摇床培养条件优化[J].浙江农业科学，2017，58(12)：2242-2245.

10.16178/j.issn.0528-9017.20171250

TS201.3

A

0528-9017(2017)12-2242-04

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