卡瓦叶子的化学成分和细胞毒活性研究

杨建香

摘要：选取卡瓦（Piper methysticum Forst. f.）叶子为材料，通过多次硅胶柱层析、凝胶柱层析等方法对各个部位进行分离纯化，然后借助于核磁共振氢谱、碳谱、质谱等方法进行结构鉴定，最终从卡瓦叶子中分离出6种化合物，分别为desmethoxyyangonin、yangonin、11-methoxyyangonin、11-methoxy-5，6-dihydroyangonin、methysticin、dihydromethysticin。采用MTT法对6种化合物进行药理活性测试，结果表明，Yangonin和11-methoxyyangonin对细胞A549（非小细胞肺癌）和细胞NCI-H460（人体肺癌细胞）有非常强的细胞毒活性，11-methoxy-5，6-dihydroyangonin、Methysticin、Dihydromethysticin对细胞A549和细胞NCI-H460则没有明显的细胞毒性。

关键词：卡瓦（Piper methysticum Forst. f.）叶子；化学成分；细胞毒活性

中图分类号：O629；R962 文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2018）20-0093-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.20.021 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： Taking leaves of Kava（Piper methysticum Forst. f.） as materials， six compounds were obtained from the EtOAc extract by a combination of column chromatography of silica gel，Sephadex LH-20 many times. Their structures were determined on the basis of 1HNMR，13C NMR，2DNMR，UV，IR，and ESIMS spectra data and were identified as Desmethoxyyangonin，yangonin，11-methoxyyangonin，11-methoxy-5，6-dihydroyangonin，methysticin，dihydromethysticin. The cytotoxicity of six compoundswas tested by MTT assay，the result showed that yangonin and 11-methoxyyangonin were very strong cytotoxicity against A549 and NCI-H460 cells，while，11-methoxy-5，6-dihydroyangonin，methysticin and dihydromethysticin were very weak cytotoxicity against A549 and NCI-H460 cells.

Key words： leaves of Kava （Piper methysticum Forst. f.）； chemical constituents； cytotoxicity

卡瓦胡椒（Piper methysticum Forst. f.）俗称卡瓦（Kava or Kawa），是瓦努阿图、斐济、汤加及所罗门群岛等南太平洋诸岛野生的一种多年生胡椒科（Piperaceae）胡椒屬（Piper）灌木类植物[1，2]。该类植物株高约2～3 m，多变异；叶大，心形，宽大于长；不结子，其繁殖完全利用根插条或分根的人工无性繁殖；大多数太平洋岛屿均有栽培，以瓦努瓦图岛为最多。人工栽培史长达2 500～3 000年，但在夏威夷的山谷中曾发现野生的卡瓦胡椒。

卡瓦胡椒的根、茎和鲜叶有很好的药用价值，有镇静催眠、抗菌杀虫、抗痉挛、局部麻醉等作用，另外还可以治疗惊厥、哮喘、焦虑症、抑郁症，对促进睡眠和提高睡眠质量也有显著疗效，且毒副作用小[2-5]。卡瓦胡椒是全球10个中草药中最畅销的中草药，目前也是欧美最畅销的中草药之一。当前关于卡瓦叶子中的化学成分研究很少，本试验通过对卡瓦叶子中化学成分进行系统研究，结果从卡瓦叶子中分离得到6种化合物，通过一维、二维核磁波谱、质谱等数据分析，鉴定出该化合物分别为desmethoxyyangonin、yangonin、11-methoxyyangonin、11-methoxy-5， 6-dihydroyangonin、methysticin和dihydromethysticin；采用MTT法对这6种化合物进行人类癌细胞株[A549（非小细胞肺癌），NCI-H460（人体肺癌细胞）]的增殖抑制活性测定，结果发现，化合物desmethoxyyangonin、yangonin、11-methoxyyangonin对细胞A549和细胞NCI-H460的半抑制浓度（IC50）小于50 μg/mL，尤其是化合物yangonin和11-methoxyyangonin有明显的细胞毒性；化合物11-methoxy-5，6-dihydroyangonin、methysticin、dihydromethysticin对细胞A549和细胞NCI-H460的IC50大于50 μg/mL，没有明显的细胞毒性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料 卡瓦叶子粉末由中国科学院华南植物园天然药物实验室提供。人肺癌细胞A549和NCI-H460均由广州中医药大学热带医学研究所馈赠。

1.1.2 试剂与仪器 提取用乙醇（95%为工业乙醇）；实验中所用的化学试剂（正己烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇等）均为分析纯试剂，由广州化学试剂厂生产；柱层析硅胶（100～200目、200～300目、300～400目）、柱层析反相硅胶Rp-C18（40 μm，60 μm）以及薄层硅胶层析板GF254均由青岛海洋化工厂生产；柱层析用凝胶Sephadex LH-20由上海生物科技有限责任公司提供；旋转蒸发仪型号为RE-2000A，由上海一凯仪器设备有限公司生产；SHZ-CD型循环水真空泵由巩义市予华仪器有限责任公司生产。质谱用VGAutospec-300型质谱仪测定；核磁共振谱用BrukerAM-400核磁共振光谱仪测定，以TMS为内标。

1.2 试验方法

1.2.1 化合物的提取 用电子天平称取已经粉碎的卡瓦粉末5 kg，用工业乙醇反复多次回流提取，合并所有的回流提取液浓缩成浸膏，加入合适比例的水混悬，然后加入一定量的乙酸乙酯，反复多次萃取，合并萃取所得液体，继续浓缩得一定量乙酸乙酯浸膏250 g。

1.2.2 化合物的分离 称取柱层析硅胶（200～300目）500 g，加入乙酸乙酯浸膏中，然后再加入适量的乙酸乙酯搅拌均匀，放置在室温下自然挥干，所得的挥干样品进行硅胶柱层析，以正己烷和丙酮两种混合溶剂梯度洗脱，再通过硅胶薄层层析板（TLC）跟踪检测，最终合并为3个馏分F1、F2和F3。

馏分F1（25 g）经硅胶柱层析（200～300目），以正己烷/丙酮（100∶0～50∶50）梯度洗脱，再经Sephadex LH-20（甲醇）层析，得到化合物1（8.22 mg）。

馏分F2（20 g）经硅胶柱层析，以石油醚/丙酮（100∶0～50∶50）梯度洗脱得到2个馏分，分别为F2-1和F2-2。F2-1经硅胶柱层析（300～400目），以石油醚/丙酮（100∶0～50∶50）梯度洗脱，所得馏分重结晶，得到化合物2（5.34 mg）。F2-2经硅胶柱层析（300～400目），以正己烷/丙酮（100∶0～50∶50）梯度洗脱，所得馏分经薄层层析板制备，得到化合物3（6.24 mg）。

馏分F3（40 g）经硅胶柱层析（200～300目），以正己烷/丙酮（100∶0～0∶100）梯度洗脱，再经薄层层析（TLC）跟踪检测，合并得到6个馏分。所得的6个馏分继续经硅胶柱层析（300～400目），反复多次层析，最终得到3种化合物，分别为化合物4（5.56 mg）、化合物5（6.18 mg）、化合物6（7.25 mg）。

1.2.3 抗肿瘤活性测试 采用MTT法[6]。在37 ℃下，收集对数生长期的肿瘤细胞以1×105个/mL的浓度接种于96孔板（100 μl/孔），5%CO2培养箱中培养24 h使细胞贴壁；然后吸去上清液，加入含试验所需浓度样品液的维持液，在37 ℃、5%CO2培养箱中培养48 h；弃药液，每孔加5 mg/mL的MTT 20 μL，继续培养4 h；终止培养，弃孔内培养液，加DMSO（150 μL/孔），置于摇床上振荡10 min，使结晶充分溶解，于酶标仪570 nm处测各孔吸光度。同时设置调零孔（培养基、MTT、DMSO），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质DMSO、培养液、MTT、DMSO）；计算细胞抑制率，细胞抑制率=[（对照-本底）-（给药-本底）]/（对照-本底）×100%。

所得数据以平均值±标准差表示，多个样本均数的比较采用单因素方差分析，组间比较用t检验，检验水准α为0.05，数据处理采用SPSS 16.0软件完成。

2 结果与分析

2.1 各化合物的试验数据

1）化合物1。白色固体，熔点（mp）为140～141 ℃。1HNMR（CDCL3，400 MHz）化学位移（δ）为7.52（2H， m），7.45（1H，d，J=15.9 Hz），7.36～7.31（3H，m），6.56（1H，d，J=16.0 Hz），5.95（1H，s），5.50（1H，d，J=1.5 Hz），3.83（3H，s）。13CNMR （CDCL3，100 MHz）δ为171.2（C），164.2（C），158.6（C），135.9（CH），135.4（C），129.6（CH），129.1（2CH），127.6（2CH），118.6（CH），101.6（CH），88.5（CH），55.9（CH3）。ESIMS（m/z）为479[2M+Na]+。

2）化合物2。淡黄色针状结晶。1HNMR（CDCL3，

400 MHz）δ为7.58（2H，d，J=8.0 Hz），7.32（1H，d，J=16.0 Hz），6.95（2H，d，J=8.0 Hz），6.75（1H，d，J=16.0 Hz），6.08（1H，d，J=2.0 Hz），5.47（1H，d，J=2.0 Hz），3.86（3H，s），3.81（3H，s）。13CNMR（CDCL3，100 MHz）

δ为171.9（C），163.4（C），161.8（C），160.0（C），135.1（CH），129.9（2CH），129.1（C），118.0（CH），115.2（2CH），101.1（CH），88.9（CH），56.6（CH3），55.7（CH3）。ESIMS（m/z）为517[2M+1]+。

3）化合物3。白色针状结晶。1HNMR（CDCL3， 400 MHz）δ为7.45（1H，d，J=16.0 Hz），7.08（1H，dd，J=2.0，8.0 Hz），7.03（1H，d，J=2.0 Hz），6.87（1H，d，J=8.0 Hz），6.45（1H，d，J=16.0Hz），5.91（1H，d，J=2.0 Hz），5.48（1H，d，J=2.0 Hz），3.93（3H，s），3.91（3H，s），3.83（3H，s）。13CNMR（CDCL3，100 MHz）δ为171.3（C），164.4（C），159.1（C），150.4（C），149.4（C），135.9（CH），128.4（C），121.4（CH），116.7（CH），111.1（CH），109.7（CH），100.7（CH），88.5（CH），56.1（CH3），56.0（CH3），56.0（CH3）。ESIMS（m/z）为577[2M+1]+。

4）化合物4。白色针状结晶。1HNMR（CDCL3，

400 MHz）δ为7.22（1H，d，J=16.0 Hz），7.18（1H，dd，J=2.0，8.0 Hz），6.94（1H，d，J=8.0 Hz），6.65（1H，d，J=16.0 Hz），6.25（1H，dd，J=4.0，16.0 Hz），5.15（1H，d，J=2.0 Hz），5.00（1H，m），3.90（3H，s），3.89（3H，s），3.87（3H，s），2.67（1H，dd，J=12.0，16.0 Hz），2.55（1H，dd，J=4.0，16.0 Hz）。13CNMR（CDCL3，100 MHz）δ為172.8（C），167.2（C），149.5（C），149.8（C），133.4（CH），129.0（C），123.9（CH），120.5（CH），111.6（CH），109.5（CH），90.8（CH），76.4（CH），56.5（CH3），56.2（CH3），56.3（CH3），33.7（CH2）。ESIMS（m/z）为581[2M+1]+。

5）化合物5。白色针状晶体。1HNMR（CDCL3，

400 MHz）δ为7.09（1H，d，J=1.6 Hz），6.95（1H，dd，J=1.6，8.0 Hz），6.83（1H，d，J=8.0 Hz），6.71（1H，d，J=16.0 Hz），6.28（1H，d，J=16.0 Hz），6.02（2H，s），5.17（1H，d，J=1.2 Hz），5.05（1H，m），3.82（3H，s），2.69（1H，ddd，J=1.2，12.0，16.0 Hz），2.59（1H，dd，J=4.8， 16.0 Hz）。13CNMR（CDCL3，100 MHz）δ为172.7（C），167.2（C），148.2（C），148.0（C），132.9（CH），129.9（C），123.7（CH），122.1（CH），108.5（CH），106.1（CH），101.5（CH2），90.8（CH），75.9（CH），55.9（CH3），33.8（CH2）。ESIMS（m/z）为549[2M+1]+。

6）化合物6。白色针状晶体，mp为118～119 ℃。1HNMR （CDCL3，400 MHz）δ为6.79（1H，d，J=8.0 Hz），6.76（1H，d，J=1.2 Hz），6.72（1H，dd，J=1.2，8.0 Hz），5.95（2H，s），5.11（1H，d，J=1.2 Hz），4.34（1H，m），3.79（3H，s），2.77（1H，m），2.67（1H，m），2.40（1H，ddd，J=1.2，12.0，16.0 Hz），2.28（1H，dd，J=4.0，8.0 Hz），2.04（1H，m），1.85（1H，m）。13CNMR（CDCL3，100 MHz）δ为173.8（C），166.8（C），148.6（C），146.7（C），136.1（C），122.0（CH），109.6（CH），108.9（CH），101.7（CH2），90.7 （CH），75.5（CH），56.5（CH3），37.3（CH2），33.4（CH2），31.4（CH2）。ESIMS（m/z）为277[M+1]+。

2.2 各化合物结构解析

1）化合物1。白色晶体，由核磁数据以及ESIMS（m/z）为479[2M+Na]+确定化合物的分子质量为228，分子式为C14H12O3，不饱和度为9。通过1HNMR谱结合13CNMR谱，化合物H的化学位移（δH）为7.52（2H，m）、7.36～7.31（3H，m），化合物C的化学位移（δC）为129.1（2CH）、127.6（2CH），说明化合物物中存在一个单取代的苯环；δH为7.45（1H，d，J=15.9 Hz）和6.56（1H，d，J=16.0 Hz），顯示该化合物中存在一对反式烯氢质子；根据不饱和度以及δH为5.95（1H，s）、5.50（1H，d，J=1.5 Hz），δC为171.2（C），说明化合物中存在一个δ-lactone环；δH为3.83（3H，s）和δC为55.9（CH3）显示存在一个氧甲基，因此该化合物是desmethoxyyangonin，其波谱数据与文献[7]对照基本一致。

2）化合物2。淡黄色针状结晶，ESIMS（m/z）为 517[2M+1]+，显示出化合物的分子质量为258，分子式为C15H14O4，不饱和度为9。1HNMR谱中，δH为7.58（2H，d，J=8.0 Hz）、6.95（2H，d，J=8.0 Hz），以及13CNMR谱显示δC为129.9（2CH）、115.2（2CH），说明化合物中存在一个对位取代的苯环；δH为7.32（1H，d，J=16.0 Hz）、6.75（1H，d，J=16.0 Hz），显示化合物中存在一对反式烯氢质子；根据不饱和度和δH为6.08（1H，d，J=2.0 Hz）、5.47（1H，d，J=2.0 Hz），以及出现的羰基信号δC为163.4（C），可以推出化合物中存在一个δ-lactone环；另外根据δH为3.86（3H，s）、3.81（3H，s），以及δC为56.6（CH3）、55.7（CH3），说明存在两个氧甲基，因此化合物的结构基本确定为yangonin，与文献[8]对照基本一致。

3）化合物3。白色针状结晶，ESIMS（m/z）为577[2M+1]+，显示出化合物的分子质量为288，结合NMR数据，推出分子式为C16H16O5，不饱和度为9。1HNMR中显示δH为7.08（1H，dd，J=2.0，8.0 Hz）、7.03（1H，d，J=2.0 Hz）、6.87（1H，d，J=8.0 Hz），说明化合物中出现一个1，2，4-三取代的苯环；而δH为3.93（3H，s）、3.91（3H，s）、3.83（3H，s），结合13CNMR谱的δC为56.1（CH3）、56.0（CH3）、56.0（CH3），显示化合物中存在3个氧甲基；通过与化合物11进行对比，发现化合物11和化合物12非常相似，惟一不同的是，化合物11苯环上的一个H被甲氧基所取代，因此化合物的结构被确定为11-methoxyyangonin，与文献[9]对照基本一致。

4）化合物4。白色针状结晶，ESIMS（m/z）为581[2M+1]+，显示该化合物的分子质量为290，分子式为C16H18O5， 不饱和度为8。通过与化合物3的分子式进行对比，发现化合物4比化合物3多了两个H，在1HNMR中，δH为5.15（1H，d，J=2.0 Hz）、5.00（1H，m）、2.67（1H，dd，J=12.0，16.0 Hz）、2.55（1H，dd，J=4.0，

16.0 Hz），说明化合物3中的一个双键发生了加氢反应，这样也解释了不饱和度少1的原因，因此化合物被确定为11-methoxy-5，6-dihydroyangonin，通过与文献[10]对照，基本一致。

5）化合物5。白色針状晶体，ESIMS（m/z）为549[2M+1]+，显示化合物的分子质量为274，结合NMR数据，推导出分子式为C15H14O5，不饱和度为9。δH为7.09（1H，d，J=1.6 Hz）、6.95（1H，dd，J=1.6，8.0 Hz）、6.83（1H，d，J=8.0 Hz），显示该化合物中有一个1，2，4-三取代的苯环；δH为6.71（1H，d，J=16.0 Hz）、6.28（1H，d，J=16.0 Hz），显示该化合物中存在一对反式烯氢质子；δH为5.17（1H，d，J=1.2 Hz）、5.05（1H，m）、 2.69（1H，ddd，J=1.2，12.0，16.0 Hz）、2.59（1H，dd，J=4.8，16.0 Hz），以及13CNMR谱中出现的酯基信号δC为167.2（C），显示化合物中存在一个δ-lactone环；根据不饱和度以及δH为6.02（2H，s），δC为148.2（C）、148.0（C）、101.5（CH2），说明化合物中存在一个包含两个氧原子的五元环，因此化合物的结构被确定为methysticin，经与文献[8]对照，基本一致。

6）化合物6。白色针状晶体，mp为118～119 ℃，ESIMS（m/z）为277[M+1]+，显示化合物的分子质量为276，结合NMR数据，推出化合物的分子式为C15H16O5，不饱和度为8。通过与化合物5比较，发现此化合物多了2个H，而通过核磁数据的比对，发现原来化合物4中的一个双键发生加H反应，这个在1HNMR、13CNMR中得到体现，δH为2.77（1H，m）、2.67（1H，m）、2.04（1H，m）、1.85（1H，m），δC为37.3（CH2）、33.4（CH2），因此化合物被确定为dihydromethysticin，通过与文献[11]对照，基本一致。

各化合物结构见图1。

2.3 各化合物抗肿瘤活性测定结果

化合物1对细胞A549和细胞NCI-H460的半抑制浓度（IC50）分别为35.813 60和37.557 22 μg/mL，化合物2对细胞A549和细胞NCI-H460的IC50分别为13.566 71和13.685 84 μg/mL，化合物3对细胞A549和细胞NCI-H460的IC50分别为12.455 32和12.338 40 μg/mL，而化合物4、化合物5和化合物6对细胞A549和细胞NCI-H460的IC50均大于50 μg/mL。由此可知，化合物2和化合物3对人类癌细胞株[A549（非小细胞肺癌）、NCI-H460（人体肺癌细胞）]有很强的细胞毒活性，化合物1对这两种细胞株有一定的细胞毒活性，而化合物4、化合物5和化合物6对这两种细胞株没有细胞毒活性。

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