林茜草根黄酮对S-180小鼠肿瘤TG-3、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ蛋白表达的影响①

刘德财，王 雪，兰 莹，于菁妮，张跃华

(1.佳木斯大学生命科学学院，黑龙江 佳木斯 154007；2佳木斯大学理学院，黑龙江 佳木斯 154007)

林茜草根黄酮对S-180小鼠肿瘤TG-3、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ蛋白表达的影响①

刘德财1，王 雪2，兰 莹2，于菁妮1，张跃华2

(1.佳木斯大学生命科学学院，黑龙江 佳木斯 154007；2佳木斯大学理学院，黑龙江 佳木斯 154007)

目的：以林茜草根醇提取总黄酮为研究对象，干预其对小鼠S-180肉瘤的抑制作用，探究抗肿瘤机制。方法：以常规ELISA检测、IH测定和RT-PCR手段，测定其在瘤体中三种蛋白TGF-β1、MHC-I、MHC-Ⅱ的上调表达；以此探索TG-3在小鼠S-180肉瘤实体瘤表面免疫蛋白分子的分泌，从而说明其分泌蛋白增强瘤体的免疫应答作用强度，以此机制制约瘤细胞在模型鼠体内移动和定置。结果：肿瘤细胞MHC-Ⅰ，MHC-Ⅱ和MHC-ⅠmRNA模型组显著减少;抗肿瘤逃逸机制和植物醇提取物总黄酮组显著增加。结论：林茜草根总黄酮可能能提高和增强宿主的免疫功能从而抑制小鼠S-180荷瘤，达到抑制肿瘤目的。

林茜草根黄酮；S-180瘤株；免疫应答；转移

应用从林茜草根中纯化提取的林茜草黄酮，以小鼠肿瘤S-180为实验主体，研究其对肿瘤细胞诱导凋亡的作用。采用黄酮类物质对小鼠体内肿瘤细胞诱导凋亡实验[1，2]，证实林茜草总黄酮提取液对S-180癌细胞的转移和定殖具有明显抑制作用，实验数据表明其具有诱导细胞凋亡和抗细胞表面抗体蛋白导致抗免疫机制，为探索中西医结合控制肿瘤的转移、复发和定殖具有重要意义，为肿瘤的综合治疗提供实验依据。以林茜草根醇提取总黄酮为研究对象，干预其对小鼠S-180肉瘤的抑制作用，探究抗肿瘤机制；以常规ELISA检测、IH测定和RT-PCR手段，测定其在瘤体中三种蛋白TGF-β1、MHC-I、MHC-Ⅱ的上调表达；以此探索TG-3在小鼠S-180肉瘤实体瘤表面免疫蛋白分子的分泌，从而说明其分泌蛋白增强瘤体的免疫应答作用强度，以此机制制约瘤细胞在模型鼠体内移动和定置。以及其对小鼠机体免疫功能的影响，探讨林茜草根醇提取物在抗肿瘤方面的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 林茜草总黄酮提取物

实验材料林茜草9月份采自黑龙江省小兴安岭腹地，带岭区凉水国家原始森林公园，超临界提取纯化总黄酮粉末，待用。

1.1.2 实验动物

实验所用小鼠为常规小鼠腹水肿瘤细胞株种鼠，瘤株型号为S-180 荷瘤小鼠，活体荷瘤鼠购置于哈医大二院附属动物实验中心；实验用小鼠为健康成年昆明种小鼠，由佳木斯大学实验动物中心提供，根据试验要求，对体重、性别、数量进行筛选，试验前经适应性饲养观察1w。

1.1.3 试剂和仪器

环磷酰胺，山西普德药业；MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ免疫组化试剂盒、SABC免疫组化检测试剂盒、DAB显色试剂盒，天津百浩公司；RNA酶(RNase)，国产，北京瑞达公司；碘化丙啶，北京泛博化学公司；核酸染液，南京赛泓瑞生物公司；TGF-β1 RNA逆转录试剂盒，上海金穗生公司；Taq DNA聚合酶、dNTP、TRIZOL-RNA提取试剂盒，上海江莱生物科技公司提供。倒置相差显微镜：CX-10型，日本Olympus公司；紫外分光光度计：UV1900型，北京普析通用公司；-美国热电公司-JENA梯度PCR仪，PowerCycler Gradient SL；北京君意东方JY04S-3G型凝胶成像分析系统：Champ GelTM 5000，软件LANE-1D，北京赛智公司。

1.2 方法

1.2.1 实验荷S-180实验小鼠模型预制

无菌条件下抽取S-180腹水瘤细胞，注入肝素钠浸润无菌采集管中；镜检瘤细胞黏度，以无菌生理盐水稀释5～10倍，注射于实验小鼠腹腔内，注意进针后皮下平行，以防刺入腹腔；单只实验目标鼠注射1.0mL经过无菌生理盐水稀释的S-180腹水瘤细胞液，浓度在1×1010～1×1011cfumL；每个周期接种8～10只传代小鼠；实验中造模时，依据以上要求，将以无菌生理盐水稀释的浓度在1×1010～1×1011cfu的S-180腹水瘤细胞液皮下接种实验小鼠的左右后肢腹股沟处[3]。

1.2.2 实验小鼠分组以及处理干预方案

依据前述的试验方案，挑选符合要求的KM实验小鼠群体，将其分为3个组别，每个组别30只，以上实验小鼠建模成功后，进行药物和对照干预，分别为空白对比组、化疗药物环磷酰胺对照组和植物-林茜草根醇提取总黄酮组；空白对照组的处理策略是每日腹腔注射无菌生理盐水0.2mL，以及0.3mL生理盐水灌胃，药物处理组采用林茜草根醇提取液的总黄酮，每日0.3mL灌胃，灌胃量控制为0.40g/kg·d，每天上午进行以上操作，灌胃、注射在上午进行，以上操作连续给药处理10d。

将注射过的荷瘤小鼠模型随机分为5组，每组10只，分别为正常组(NG)、模型组(MG)、总黄酮组(TFG)、化疗药物环磷酰胺组(CTX)和共同作用组 (TFG+CTX)。普通对照组(NG)：无菌生理盐水干预组，剂量为每日0.4mL/只；造模对照组(MG)：无菌生理盐水干预，每天灌胃0.4mL/只；植物醇提取物总黄酮组(TFG)：干预情况如下，每日每只TFG灌胃240mg/ kg；化疗药物 (CTX)：无菌生理盐水干预每天0.4mL/只，CTX尾部静脉注射，第3天开始注射，注射剂量为每日100mg /kg·只；共同干预组别(TFG+CTX)处理如下： TFG灌胃每天每只240mg/ kg·只，至第3天，CTX干预，腹腔注射每天、每只100mg/kg。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 总RNA提取

依据试剂盒提供的方法PCR扩增，并逆转录合成cDNA，实体瘤组织细胞中的总RNA提取依据市售的RNA提取试剂盒说明书要求操作。将样品分为3份，1份电泳，1份用于测定纯度RNA，1份备用，置于-80℃冰箱冻干保存备用。

2.2 实体肿瘤组织cDNA的反转录要求

反转录操作合成cDNA按照附带的RT-PCR Kit说明要求步骤。五局条件下，反应体系总体积10μL，按照说明书要求分别加入各种要求试剂混匀，进行反转录合成DNA反应；反应过夜后，反转录合成的产物置于超低温冰箱存放。

2.3 实验小鼠瘤细胞株中PCR扩增和凝胶电泳分析MHC-ⅠmRNA表达

依据试剂盒说明书要求步骤进行反转录PCR合成反应。步骤要求如下：

总反应体系体积为50μL，配制PCR反应液：将混合体系中各个试剂加入混匀，保持备用；离心后，进行PCR合成操作，结束后再用加样器吸取5.0μL的PCR产物和2.5μL内标以及1μL (6×)样品buffer混匀，点至2%琼脂糖凝胶电泳板孔内，其中琼脂糖凝胶预先融入，溴化乙锭染料的加入剂量比例为琼脂糖凝胶体积的5%混合于电泳胶板，在冷却条件下，低温电泳，以防止产物分解，电泳参数如下：电泳电压控制在100～120V，电泳时间为60min。

2.4 凝胶电泳产物判读

琼脂糖电泳胶板经过凝胶板荧光染料着色，方法采用Gold-Veiw DNA染色用的电泳条带分析法；图像用软件Bio-Rad Quantity one 5.0自带的数据分析系统判读，软件半定量分析各个基因条带的光密度，结果用内置的参照β-actin比值显示。

2.5 蛋白免疫组化TG-3、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ判读

实验样本的免疫组织化学素材图像分析采用分析软件Pro-Plus-Image处理；取采集到的MHC-Ⅰ和 MHC-Ⅱ切片图像判读，样品切片、染色后，每张选取分散视野中的5个区域测定S-180小鼠肿瘤组织的积分光密度值(IOD值)，每张样片图像判读数字，取算数平均值代表MHC-Ⅰ同MHC-Ⅱ相对应的蛋白表达的强度，实验数据依据统计学示意，统计分析，求平均数，ANOVA单因素方差分析，LSD法作两两比较SPSS-13.0软件操作,见表1。

表1 各实验组对S-180实验鼠瘤体MHC-I和MHC-Ⅱ蛋白表达的影响

注：与模型组比较，*P<0.05。

2.6 TFG对荷S-180小鼠瘤组织中MHC-ⅠmRNA表达检测

荷瘤小鼠组织总RNA提取依据试剂盒Trizol-10要求操作，按前述的方法用紫外分光光度计测定其表达的强度以及提取的质量鉴定。同健康组小鼠组织细胞中MHC-ⅠmRNA基因表达同肿瘤细胞表达相比，下降显著；与模型组对照比较比较，各个药物干预组表达指标呈明显上升势头,见表2。

表2 各个处理组对荷瘤鼠S-180组织中MHC-ⅠmRNA分泌比较

注：与模型组比较，*P<0.05。

3 讨论

机体在产生肿瘤后，会发生肿瘤的免疫逃逸，即肿瘤细胞可以在免疫系统的监控攻击中凭借多种方法逃避攻击从而继续分裂生长的现象。生命体特异性免疫系统在启动清除肿瘤细胞免疫过程中，肿瘤抗原表达、抗原识别、加工、提呈、T细胞增殖、活化和分化以及免疫效应的产生这一系列环节[5]，需要启动肿瘤抗原的鉴定，捕获，加工；主要呈现为两个方面：抗原呈递细胞的共刺激分子信号转导的协同效应，通路的激活；特异性识别并杀死肿瘤细胞I类分子的限制性表达[6]。研究发现，主要组织相容性复合体(MHC)I类分子和共刺激减少或薄弱和缺少的元素表达缺失，导致免疫细胞反应无能、肿瘤细胞普遍存在的生物学现象中的细胞表面表达[7]，也导致癌细胞逃避免疫监视，意味着一个重要特异性抗免疫反应发生的逃逸机制[8]。

实验结果表明，林茜草黄酮能增加免疫分子MHC-I，MHC-Ⅱ的肿瘤细胞表面的表达，增强特异性细胞的抗肿瘤免疫反应的作用，对于癌症病人的临床实践期间，抑制残余肿瘤细胞体内转移和重要措施防止复发。由上可知，肿瘤细胞MHC-Ⅰ，MHC-Ⅱ和MHC-ⅠmRNA模型组显著减少;抗肿瘤逃逸机制和TFG组显著增加。说明林茜草总黄酮可上调免疫分子的肿瘤细胞表面的表达，提高特定细胞的抗肿瘤免疫应答的功能，抑制肿瘤细胞的体内转移和复发。

[1]中华人民共和国药典委员会. 中华人民共和国药典[M]. 北京: 化学工业出版社, 2000:245-247

[2]中国医学科学院药用植物资源开发研究所. 茜草属药用植物的研究-Ⅰ.中药茜草的原植物与国内资源[J]. 天然产物研究与开发，1991, 13(4):7-15

[3]侯柏玲, 王素贤. 林茜草化学成分的研究[J]. 中草药,2000, 31(7):492-494

[4]华会明, 王素贤, 吴立军,等. 茜草中萘酸酯类成分的研究[J]. 药学学报, 1992，27(40): 279-281

[5]张华, 曲震寰, 王莹, 等. 小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养与吞噬功能测定[J]. 黑龙江医药科学, 2007, 30(5):9-10

[6]Liu Xi, Li Fei and Zhang Li. Experimental Research on the Effects of the Honey-Boiled Parent Root of Aconitum Carmichael on the Immune Function in the H (22)-Bearing Mice[J]. Beijing University of Traditional Chinese Medicine, 2004, 27(2):68-70

[7]吕延杰主编. 药理学实验指导[M]. 北京: 人民卫生出版社，2008:117

[8]白玉静, 佟丽华. 香菇多糖提取工艺和含量测定方法研究[J]. 黑龙江医药科学, 2006, 29(1): 55-56

EffectofRubiasylvaticagrassrootsflavonoidsontheexpressionofTG-3,MHC-IandMHC-IIproteinsinS-180mice

LIUDe-cai1,WANGXue2,LANYing2,YUJing-ni1,ZHANGYue-hua2

(1.The College of Life Science, Jiamusi University, Jiamusi 154007, China;2.The College of Science, Jiamusi University, Jiamusi 154007, China)

ObjectiveTo discuss the inhibitory effect of Rubia sylvatica grassroots flavonoids to mouse sarcoma S-180 and explore its anti-tumor mechanism.MethodDetection of TGF-β1, MHC-I, MHC-Ⅱ protein by ELISA, IH and RT-PCR methods in tumor tissues was to reveal the secretion of TG-3 in mice S-180 sarcoma tumor surface, so that the secreted proteins enhanced the immune response intensity of tumor which restricted the movement and location of the tumor cell in mice.ResultsThe expression of MHC-I, MHC-Ⅱ and MHC-ⅠmRNA were significantly reduced in model group; a obviously increase in anti-tumor escape mechanism was observed in plant alcohol extract of total flavonoids group.CconclusionRubia sylvatica Nakai of total flavonoids can improve and enhance the host immune function, thereby exerts an inhibitory effect to mouse sarcoma S-180.

Rubia sylvatica flavonoids; S-180 tumor lines; immune response; transfer

黑龙江省卫生厅科学技术研究项目，编号：2012-268。

刘德财(1974～)男，黑龙江佳木斯人，硕士，高级实验师。

张跃华(1962～)男，黑龙江佳木斯人，博士，副教授。E-mail:zhangyaohua_2008@163.com。

R285.5

A

1008-0104(2017)06-0022-03

2017-06-19)