超声法提取紫皮石斛多糖工艺的研究

葛颖华 周 萃 邬 科 何国浓

浙江省宁波市中医院 浙江 宁波 315000

超声法提取紫皮石斛多糖工艺的研究

葛颖华 周 萃 邬 科 何国浓#

浙江省宁波市中医院 浙江 宁波 315000

紫皮石斛 超声提取 苯酚-硫酸法 多糖

紫皮石斛为双子叶植物药兰科植物齿瓣石斛Dendrobium devonianum Paxt.的干燥茎，具有滋阴清热、益胃生津、润肺止咳、益肾明目的功效，主要用于热病伤津或胃阴不足之舌干口渴、阴虚津亏之虚热不退等症，分布于我国的云南、广东、广西、贵州等省[1-2]。石斛的化学成分主要为多糖、生物碱、菲类、联苄类［3-4］，其中多糖是其发挥药效的重要物质基础。2015年版《中国药典》收载的石斛主流品种有金钗石斛、鼓槌石斛、流苏石斛和铁皮石斛等，其中以铁皮石斛功效最佳，研究表明紫皮石斛富含黏液，化学成分及药理作用类似铁皮石斛，主要活性成分多糖的含量也可与铁皮石斛相媲美，且其价格相对铁皮石斛便宜较多，可谓物美价廉［5-6］。

目前，关于紫皮石斛多糖类成分的提取方法研究较少，且存在提取时间长、操作复杂的缺点。本研究通过对超声法与回流提取法的比较发现，在相同条件下，超声法的提取效率可达到回流提取的80%以上，并通过正交试验系统考察了超声法的提取条件，最终确定了超声法提取紫皮石斛多糖的最佳提取工艺，为紫皮石斛多糖含量的快速分析提供了参考。

1 材料与仪器

1.1 材料：紫皮石斛采自浙江省乐清县，经宁波市中医院王杰主任中药师鉴定为真品，60℃下烘干并过80目筛；葡萄糖对照品（中国药品生物制品检定所）；水为纯化水，苯酚、硫酸均为分析纯。

1.2 仪器：AL204电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)，202-2型干燥箱（浙江诸暨电热仪器厂），HH.S21-4S电热恒温水浴锅（上海跃进医疗器械有限公司），KQ-300GVDV型三频恒温数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），722S可见分光光度计（上海棱光技术有限公司）。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备：精密称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖对照品适量，至100ml容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，得1.137mg/ml的葡萄糖对照品母液。精密量取2ml葡萄糖对照品母液至25ml量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，制成90.96µg/ml的溶液，作为对照品溶液，备用。

2.2 线性关系考察：精密量取葡萄糖对照品溶液0.05ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.8ml、1.0ml置10ml具塞试管中，加水至1.0ml，精密加入5%苯酚溶液1ml（临用前现配制），摇匀，再精密加入硫酸5ml，摇匀，置沸水浴中加热20min，取出，放入冰水浴中冷却5min，以相应的试剂为空白，在488nm的波长处测定吸光度，以吸光度Y为纵坐标，浓度X（µg/ml）为横坐标，绘制标准曲线，回归方程为：Y=0.0745X+0.044，r=0.9938。结果表明多糖在0.65～12.99µg/ml。结果见图1。

2.3 紫外分光光度法测定紫皮石斛多糖含量：取紫皮石斛粉末（80目）约0.15g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入一定体积的水，称定重量，超声提取（功率250W，频率20kHz）一定时间后，取出，冷却，再称定重量，用水补足减失重量，滤过。精密量取续滤液1ml，至25ml容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，取1ml置10ml具塞试管中，按2.2项“精密加入5%苯酚溶液1ml”起操作，在488nm波长下测定吸光度并计算其含量。

2.4 提取方法的选择：方法一：取紫皮石斛药材粉末（过80目筛）约0.15g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水100ml，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz）30min，放冷，再称定重量，用水补足损失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

方法二：取紫皮石斛药材粉末（过80目筛）约0.15g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入水100ml，110℃加热回流，提取1.5h，滤过，取续滤液，即得。

两种提取方法多糖含量测定及比较：分别精密量取上述两种提取溶液各1ml，至25ml容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，取1ml置10ml具塞试管中，按2.2项“精密加入5%苯酚溶液1ml”起操作，在488nm波长下测定吸光度并计算其含量。结果见表1。

表1 提取方法考察表

结果表明，在取样量及提取溶剂相同的条件下，紫皮石斛药材粉末经超声及回流提取，多糖含量都相对较高，但采用超声提取仅30min就可达到回流提取效率的80%以上，且操作简便，故选用超声法并系统考察其提取条件。

2.5 正交试验：采取正交试验设计，选用A（超声时间）、B（超声次数）、C（提取倍量）、D（提取温度）4个因素，每个因素3个水平对超声提取法进行考察，用L9（34）正交表做实验设计。结果见表2。以紫皮石斛中多糖的含量为评价指标进行直观分析、方差分析。结果见表3、表4。

表2 正交因素水平表

表3 紫皮石斛多糖正交试验数据及直观分析表

表4 紫皮石斛多糖正交试验方差分析表

表3结果表明，D（提取温度）对提取率的影响最为显著（P＜0.05），A（超声时间）、B（超声次数）、C（提取倍量）对提取率的影响相对较小。综合评分数据的极差大小显示各因素主次为D＞A＞C＞B。D（提取温度）中，均值1＞均值2＞均值3，说明紫皮石斛多糖在超声提取条件下，在提取温度达到30℃时，多糖溶出效果最好，因此最佳提取条件筛选为D1A3C2B2；结合方差分析结果，D（提取温度）对提取效果有极显著意义，A（超声时间）对提取效果也呈现一定的显著性，考虑到各因素影响主次，结合能效，最终确定最佳工艺条件为D1A3C1B1，即提取温度30℃，超声提取40min，超声1次，提取倍量为200倍时，多糖提取效果最好。

2.6 方法可行性试验：具体分述如下。

2.6.1 精密度试验：精密吸取葡萄糖对照品溶液6份，置10ml具塞试管中，加水至1.0ml，按2.2项“精密加入5%苯酚溶液1ml”起操作，在488nm波长下测定吸光度并计算其含量，RSD值为2.72%，小于3%，表明仪器精密度良好。结果见表5。

表5 精密度试验结果

2.6.2 重复性试验：取同一批次的紫皮石斛样品6份，每份约0.15g，精密称定。按筛选出的条件进行超声提取，按2.3项下方法操作，测定吸光度并计算每份样品中的多糖含量，RSD值为2.87%，小于3%，表明方法重复性良好。结果见表6。

2.6.3 加样回收率试验：精密量取已知含量的样品溶液6份（多糖含量43.81%），每份0.5ml，置10ml具塞试管中，精密加入葡萄糖对照品溶液0.4ml，加水补至1ml，按2.2项“精密加入5%苯酚溶液1ml”起操作，在488nm波长下测定吸光度计算加样回收率。见表7。

表6 重复性试验结果

表7 加样回收率试验结果

2.6.4 稳定性试验：取紫皮石斛样品约0.15g，精密称定。按筛选出的条件进行超声提取，按2.3项下方法操作，提取后样品于常温下放置10min、0.5h、1h、2h、4h、6h后，分别测定吸光度并计算每份样品中的多糖含量，RSD值为2.32%，小于3%，表明样品的稳定性良好。结果见表8。

表8 稳定性试验结果

3 小结

本研究采取超声法和回流提取法比较了不同提取方法对石斛多糖含量的影响，在取样量及提取溶剂相同的条件下，采用超声提取仅30min就可达到回流提取效率的80%以上，且操作简便，故选用超声法并系统考察其提取条件。以超声时间、超声次数、提取倍量、提取温度4个因素，每个因素3个水平对超声提取法进行考察，结果显示，提取温度30℃，超声提取40min，超声1次、提取倍量为200倍时，多糖提取效果最好，且该方法重现性好、稳定性好，可作为提取紫皮石斛多糖的工艺。

[1]沈洁琼，徐建.铁皮石斛、杯鞘石斛、齿瓣石斛的指纹图谱研究[J].浙江中医杂志，2015，50(7)：534-536.

[2]张爱莲，于敏，徐宏化，等.齿瓣石斛的化学成分及其抗氧化活性[J].中国中药杂志，2013，38(6)：844-847.

[3]Bi Z M，Wang Z T，Xu L S.Chemical constituents of Dendrobium moniliforme[J].Acta Bot Sin，2004，46（1）：124-126.

[4]Yang L，Wang Z T，Xu L S.Simultaneous determination of phenols(bibenzyl，phenanthrene，and fluorenone in Dendrobium species by high-performance liquid chromatography with diode array detection[J].J Chromatography A，2006，1104(1-2)：230-237.

[5]吕佳妮，陈素红，徐娟华.铁皮石斛根中石斛多糖的响应面法提取优化研究[J].浙江中医杂志，2014，49（6）：459-461.

[6]甘小娜，徐英，徐红，等.紫皮石斛的质量标准研究[J].中国中药杂志，2013，38（23）：4113-4118.

# 通讯作者：何国浓，E-mail：nbszyykjk@163.com

2017-06-07