苯二酚内酯及其衍生物杀线虫活性研究

张荣儒, 张礼文, 张 鹏, 章跃陵, 刘 柱, 徐玉泉*

1.中国农业科学院生物技术研究所, 北京 100081; 2.汕头大学理学院, 广东 汕头 515063；3.海南大学热带农林学院, 海口 570228

苯二酚内酯及其衍生物杀线虫活性研究

张荣儒1，2，3, 张礼文1, 张 鹏1, 章跃陵2, 刘 柱3*, 徐玉泉1*

1.中国农业科学院生物技术研究所, 北京 100081; 2.汕头大学理学院, 广东 汕头 515063；3.海南大学热带农林学院, 海口 570228

采用浸渍法研究了酿酒酵母异源表达的苯二酚内酯monocillin II、10,11-dehydrocurvularin、pre-asperfuranone、trans-resorcylide、desmethyl-lasiodiplodin和lasiodiplodin的杀秀丽线虫活性。首次发现苯二酚内酯10,11-dehydrocurvularin和desmethyl-lasiodiplodin具有杀线虫活性。分别以0.1 mg/mL、0.2 mg/mL 和0.5 mg/mL的10,11-dehydrocurvularin和desmethyl-lasiodiplodin处理秀丽线虫的二龄幼虫(L2)24 h后，秀丽线虫的校正死亡率分别为7.95%、15.30%、46.41%和3.41%、8.90%、27.47%。Desmethyl-lasiodiplodin的甲基化产物lasiodiplodin的杀线虫活性降低，浓度为0.5 mg/mL时，线虫的校正死亡率为16.12%。研究结果为植物线虫病害的防治提供了新的思路。

苯二酚内酯；秀丽线虫；10,11-dehydrocurvularin；desmethyl-lasiodiplodin；杀线虫活性

植物线虫病是小麦、水稻和马铃薯等粮食作物及番茄、黄瓜和松树等经济作物的主要病害之一，全球每年因作物病原线虫造成的直接经济损失高达1 570亿美元[1]。植物线虫为专性寄生生物，在侵染植物组织后，既吸取植株营养，又分泌一些酶或毒素，使植物的组织发生病变，影响植株水分和营养的吸收与运转，甚至导致植株死亡[2]。

利用化学杀线虫剂防治线虫病害是最主要的农业措施，但大部分商业化的杀线虫剂对人畜有较高毒性，且对环境有害，如灭线磷、克百威和涕灭威等，现已经被取消或限制使用。近年来国内线虫病害呈快速上升趋势，而生产中使用的杀线虫剂品种单一，长期使用必然导致抗药性，因此需要开发新的杀线虫剂。利用微生物合成的次级代谢产物开发新的杀线虫剂，目前已成为国内外的研究热点[3]。

真菌能够合成丰富的次级代谢产物，其中由聚酮合酶(PKS)催化合成的聚酮类化合物以结构和活性多样著称[4]，其中阿维菌素就有显著的杀线虫活性，目前已在生产中大量使用。苯二酚内酯(benzenediol lactones，BDLs)是聚酮化合物中重要的一类，根据其骨架结构可以分为二羟基苯甲酸内酯(resorcylic acid lactones，RALs)和二羟基苯乙酸内酯(dihydroxyphenylacetic acid lactones，DALs)[4]，其结构多样且具有多种生物活性[5]。例如根赤壳菌素(radicicol)能够抑制Hsp90分子伴侣蛋白的合成，具有抗肿瘤的活性[6]；玉米赤霉烯酮(zearalenone)导致秀丽线虫的体长变短、后代生殖能力降低，从而表现出杀线虫活性[7]。因此，本研究通过在酵母中异源表达10,11-dehydrocurvularin和desmethyl-lasiodiplodin等6种苯二酚内酯聚酮类化合物，采用浸渍法筛选这些化合物的杀秀丽线虫(Caenorhabditiselegans)活性，并对他们的杀线虫活性进行比较，为开发新的杀线虫剂提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

本实验中合成苯二酚内酯及其衍生物的质粒和酿酒酵母菌株BJ5464-NpgA均由本课题组保存。苯二酚内酯及其衍生物的详细信息如表1所示。供试线虫为秀丽线虫，伊维菌素购自齐鲁动物保健有限公司。

表1 苯二酚内酯及其衍生物的结构Table 1 Construction of benzenediol lactones and derivatives.

1.2 方法

1.2.1供试苯二酚内酯及其衍生物的异源表达[8]用Frozen EZ Yeast Transformation Ⅱ(TZ001)试剂盒将含有合成苯二酚内酯基因的质粒转入到酿酒酵母中，在Trp和Ura二缺(或-Leu-Trp-Ura三缺)SC培养基上筛选双(3个)质粒酵母转化菌落。挑取二缺(三缺)SC培养基平板转化菌落，接种到25 mL相应的SC液体培养基中，28℃，220 r/min摇床培养；培养约24 h至OD600=0.6，加入等体积1%葡萄糖的酵母丰富培养基，继续发酵；培养72 h后，用乙酸乙酯萃取；反向高效液相色谱(HPLC)检测，确定后大规模发酵。

1.2.2供试苯二酚内酯及其衍生物的分离纯化[9]将粗提物用适量甲醇溶解后，与100～200目硅胶拌匀；称取300～400目硅胶(粗提物:300～400目硅胶质量比=1∶13～1∶15)加入一定体积的石油醚，用玻璃棒搅拌成匀浆后，湿法装柱。上样后流动相洗脱，收集流分后，洗脱液依次为石油醚、石油醚与乙酸乙酯混合物(石油醚与乙酸乙酯的比例根据所提取的化合物不同而变化)、甲醇。

将收集到的流分用薄层色谱硅胶板(TLC)检测后，相同比移值(Rf)的组分合并后用旋转蒸发仪蒸干，用HPLC检测，以确定目标化合物。再将其进一步分离，最后用HPLC在210 nm下检测化合物的纯度，称重后4℃保存。

1.2.3制备秀丽隐杆线虫二龄幼虫悬浮液 利用网筛法制备秀丽隐杆线虫二龄幼虫悬浮液。已经灭菌的金属网筛摆放于烧杯中，从上到下的网筛依次为200目(75 μm)、400目(38 μm)、625目(20 μm)，向烧杯中加入M9缓冲液，直至溶液界面到达625目网筛的中部；用M9缓冲液冲洗NGM培养基平板上的线虫后，将含有线虫的M9缓冲液加入到最上层筛网上，于超净台静置；约12 h后，用5 mL的移液枪沿着烧杯内壁与筛子外侧的缝隙，缓慢把缓冲液全部吸走，依次取出200目、400目、625目网筛，最后收集的线虫即为二龄幼虫。然后将秀丽线虫悬浮液稀释或者离心富集，制成浓度约600条/mL的秀丽隐杆线虫二龄幼虫悬浮液，以供毒力生物测定。

1.2.4确定合适的溶剂及助溶剂 采用浸渍法[10]测定甲醇、二甲基亚枫(DMSO)和Tween 80对秀丽线虫2龄幼虫的影响。活性测试选择在24孔板中进行，测试体系(线虫数量为60条，总体积为500 μL)如表2所示，于培养箱中20℃黑暗孵育。

表2 有机溶剂及助溶剂测试体系Table 2 Test system of organic solvents and cosolvent.

待孵育24 h后，在解剖镜下观察线虫，统计线虫的死亡率，对于线虫死亡的检验方法为：用针刺线虫，僵直不动者为死亡，弯曲或明显钩状为活体。处理组和对照组，每组设3个平行。采用同样的方法测试有机溶剂和Tween 80混合对线虫的影响。

1.2.5苯二酚内酯及其衍生物对秀丽线虫2龄幼虫的影响 将苯二酚内酯及其衍生物分别用DMSO溶解，制成100 mg/mL的母液，置4℃保存备用；再将上述化合物稀释成50 mg/mL、20 mg/mL、10 mg/mL置4℃保存备用；活性测试选择在24孔板中进行，测试体系(线虫数量为60条，总体积为500 μL)如表3所示。于20℃黑暗孵育24 h；最终体系中DMSO的终浓度为1%，Tween 80的终浓度为0.1%；统计线虫的死亡率，处理组和对照组重复3次。

表3 苯二酚内酯及其衍生物的测试体系Table 3 Test system of BDLs and their derivatives.

1.3 统计学分析

为了消除线虫自然死亡对实验的影响，因此采用校正死亡率[11]计算杀线虫活性。

2 结果与分析

2.1 有机溶剂及助溶剂对线虫的影响

采用浸渍法测定1%的甲醇、1% DMSO、0.1% Tween 80及有机溶剂和Tween 80混合对线虫的影响，数据处理采用独立样品的t检验(95%的置信区间)。

如图1所示，当体系中DMSO、甲醇的终浓度为1%时，处理组线虫的死亡率和对照组M9的线虫死亡率没有显著性差异(P>0.05)；当体系中的助溶剂Tween 80终浓度为0.1%时，处理组线虫的死亡率和对照组M9的线虫死亡率没有显著性差异(P>0.05)；当体系中DMSO 1%-Tween 80 0.1%或者甲醇 1%-Tween 80 0.1%时，处理线虫的死亡率和对照组M9的线虫死亡率没有显著性差异(P>0.05)，表明当体系中存在DMSO 1%-Tween 80 0.1%对线虫没有伤害。

2.2 苯二酚内酯及其衍生物的杀线虫活性

采用浸渍法测定不同浓度苯二酚内酯及其衍生物的杀线虫活性，结果如图2所示，供筛选的6种苯二酚内酯及其衍生物，处理24 h后，10,11-dehydrocurvularin表现出了较强的杀线虫活性，在0.5 mg/mL、0.2 mg/mL和0.1 mg/mL，其校正死亡率分别为46.41%±8.54%、15.30%±5.60%和7.95%±2.71%；desmethyl-lasiodiplodin的杀线虫活性较弱，浓度在0.5 mg/mL、0.2 mg/mL和0.1 mg/mL时，其校正死亡率分别为27.47%±2.19%、8.94%±0.64%和3.41%±0.62%。

图1 有机溶剂及助溶剂对线虫的影响Fig.1 Effects of organic solvents and solvents on Caenorhabditis elegans.注:对照：M9缓冲液；DMSO：体系中DMSO的终浓度为1%；甲醇：体系中甲醇的终浓度为1%；Tween 80：体系中Tween 80终浓度为0.1%；DMSO+T:体系中DMSO的终浓度为1%，Tween 80的终浓度为0.1%；甲醇+T：体系中甲醇的终浓度为1%， Tween 80的终浓度为0.1%。

图2 苯二酚内酯及其衍生物的杀线虫活性Fig.2 The nematocidal activities of benzenediol lactones and derivatives.

Monocillin II、trans-resorcylide和pre-asperfuranon在0.5 mg/mL下，其校正死亡率均不超过10%。阳性对照伊维菌素浓度为0.2 mg/mL和0.1 mg/mL时，其校正死亡率分别为10.12%±0.17%和5.67%±1.26%。因为本实验中所用的伊维菌素浓度大于0.2 mg/mL，会产生严重的遮盖，无法统计线虫的死亡率。

对10,11-dehydrocurvularin、desmethyl-lasiodiplodin、lasiodiplodin和阳性对照伊维菌素在0.2 mg/mL时的校正死亡率进行单因素方差分析，如图2所示，在0.2 mg/mL时，10,11-dehydrocurvularin、desmethyl-lasiodiplodin、lasiodiplodin和伊维菌素的校正死亡率无显著性差异。

对desmethyl-lasiodiplodin和lasiodiplodin在0.5 mg/mL时，线虫的校正死亡率进行单因素方差分析，desmethyl-lasiodiplodin与lasiodiplodin校正死亡率存在显著性差异(P<0.05)。对desmethyl-lasiodiplodin、lasiodiplodin浓度在0.2 mg/mL时的校正死亡率进行单因素方差分析，desmethyl-lasiodiplodin与lasiodiplodin校正死亡率无显著性差异(P>0.05)。

在体视显微镜下(目镜10×，物镜40×)观察死亡的线虫，如图3(彩图见图版三)所示，死亡的线虫僵直不动，活的线虫成弯曲状。从图中可以看出活的线虫口、咽和肠道保持完好。而死亡的线虫其体内已经看不清这些器官，器官组织已经成分散状。

3 讨论

本文通过异源表达和浸渍法的方法，研究了苯二酚内酯及其衍生物的杀线虫活性。首次发现10,11-dehydrocurvularin和desmethyl-lasiodiplodin的杀线虫活性。

图3 秀丽线虫L2在处理前(A)和BDLs处理24 h后(B)对比Fig.3 Comparation of Caenorhabditis elegans L2 before (A) and after immersing in BDLs for 24 h (B).注：1:线虫的口；2:线虫的咽；3:线虫的肠(彩图见图版三)

Kusan等[12]从青霉的菌丝体和发酵液中分离得到4种苯二酚内酯化合物，当11-hydrocurvularin、β,γ-dehydrocurvularin、11-β-hydroxy-12-oxo-curvularin、12-oxo-curvularin的浓度为300 mg/L时，根腐线虫(Pratylenchusspp.)死亡率分别是35%、80%、23%和33%。

Dong等[13]从真菌CaryosporacallicarpaYMF1.01026中分离得到3个BDLs类似结构化合物，当caryospomycins A～C的浓度为200 mg/L时，松材线虫(B.xylophilus)的死亡率分别是57.1%、47.8%和38.5%。10,11-Dehydrocurvularin和desmethyl-lasiodiplodin在200 mg/L时，秀丽线虫的校正死亡率分别为15.30%和8.90%。但是在本实验中，当化合物浓度为200 mg/L时，10,11-dehydrocurvularin、desmethyl-lasiodiplodin、lasiodiplodin和阳性对照伊维菌素的校正死亡率无显著性差异。苯二酚内酯及其衍生物杀线虫活性的差异可能不仅与受测线虫有关，也与其结构有关。

为了验证BDLs的结构与其杀线虫活性有无特定的关系，将具有杀线虫活性BDLs及其衍生物聚类分析。结果表明成环的前体pre-asperfuranone(RAL)没有杀线虫活性；14元环的DALs暂时没有文献报道是否有杀线虫活性；12元环RALs(desmethyl-lasiodiplodin)、12元环DALs(11-hydrocurvularin、β,γ-dehydrocurvularin、11-β-hydroxy-12-oxo-curvularin、12-oxo-curvularin和10,11-dehydrocurvularin)和14元环RALs(caryospomycins A～C)均存在杀线虫活性化合物。这表明BDLs杀线虫的活性与其骨架结构(RALs、DALs)没有特定的规律。

根据文献报道伊维菌素杀线虫机制主要是作用于氯离子通道，导致线虫的死亡[14]。在秀丽隐杆线虫中的转化生长因子β(transorming growth facter β，TGF-β)信号通路在秀丽线虫的先天性免疫系统发挥重要作用。Rudolph等[15]研究发现TGF-β的受体不会被10,11-dehydrocurvularin抑制，但是10,11-dehydrocurvularin通过阻断Smad转录因子与DNA上CAGA序列的结合，导致TGF-β信号通路的中断。进一步的研究发现10,11-dehydrocurvularin能够引起TGF-β调控的下游基因表达降低，如pai-1、pdgf、smad7和mmp-2等，甚至在HepG2细胞内引起了tgf-β的下调。因此10,11-dehydrocurvularin杀线虫活性可能与TGF β-Smad信号通路有关。

既往研究证实Desmethyl-lasiodiplodin的-OH是其生物活性如抗肿瘤、抗菌的重要基团，其苯环上的-OH修饰为-OCH3后引起了其抗肿瘤、抗菌能力的下降[16,17]。Buayairaksa等[16]研究发现与desmethyl-lasiodiplodin相比，lasiodiplodin对KB、BC1和NCI-H187的IC50分别上升了1.6倍、2.7倍和1.9倍。Yang等[17]研究发现desmethyl-lasiodiplodin对金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis)和尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusariumoxysporumf. sp.cubense)的IC50分别为6.25 μg/mL、12.5 μg/mL、12.5 μg/mL、100 μg/mL和50 μg/mL；但是lasiodiplodin对这些病菌的IC50分别上升了4倍、4倍、8倍和2倍。在本研究中，在0.5 mg/mL时，与desmethyl-lasiodiplodin相比，lasiodiplodin处理下的线虫校正死亡率下降了1.7倍，这表明desmethyl-lasiodiplodin苯环上的-OH也是其杀线虫活性的重要基团。

和大多数农药原药一样，苯二酚内酯及其衍生物不易溶于水。在后续的实验中，一方面将利用组合生物学对其结构进行修饰，如将其苯环上的-OH进行糖基化，甲基化等修饰增强其水溶性，另一方面将通过研究不同溶剂和乳化剂的配比制成合适的农药剂型，以便其更好的应用于生产。

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StudiesontheNematocidalActivitiesofBenzenediolLactonesandTheirDerivatives

ZHANG Rongru1,2,3, ZHANG Liwen1, ZHANG Peng1, ZHANG Yueling2, LIU Zhu3*, XU Yuquan1*

1.BiotechnologyResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081,China; 2.CollegeofScience,ShantouUniversity,GuangdongShantou515063,China; 3.InstituteofTropicalAgricultureandForestry,HainanUniversity,Haikou570228,China

Benzenediol lactones(BDLs) and their derivatives, including monocillin II, 10,11-dehydrocurvularin, pre-asperfuranone, trans-resorcylide, desmethyl-lasiodiplodin and lasiodiplodin， were obtained by heterologous biosynthesis in yeast. Their nematocidal activities were researched in this study. For the first time, 10,11-dehydrocurvularin and desmethyl-lasiodiplodin were found with nematocidal activity. After treatingCaenorhabditiseleganswith 0.1 mg/mL, 0.2 mg/mL and 0.5 mg/mL of 10,11-dehydrocurvularin and desmethyl-lasiodiplodin for 24 h, respectively, the corrected mortality rate ofC.eleganswas 7.95%, 15.30%, 46.41% and 3.41%, 8.90%, 27.47%. Nematocidal activity of lasiodiplodin was decreased, and the corrected mortality rate with 0.5 mg/mL was 16.12%. This study provided a new idea for the prevention and cure of plant nematode disease.

benzenediol lactones;Caenorhabditiselegans; 10,11-dehydrocurvularin; desmethyl-lasiodiplodin; nematicidal activity

2017-04-13;接受日期2017-06-14

国家自然科学基金项目(31560021)；农业部948计划项目(2016-X43)；国家国际科技合作专项(2015DFR31060)；海南省重点研发计划(ZDYF2017020)资助。

张荣儒，硕士研究生，主要从事微生物防治植物病害研究。E-mail:zzru2010@126.com。*通信作者：刘 柱，教授，主要从事微生物农药研究。E-mail:zhuliu@hainu.edu.cn;徐玉泉，研究员，主要从事微生物次生代谢产物的研究。E-mail:xuyuquan@caas.cn

10.19586/j.2095-2341.2017.0026