拟青霉A20140822发酵生产虫草素工艺的响应面优化研究

郑 威, 周迎红, 刘金龙

1.湖北省农业科学院农业经济技术研究所, 武汉 430064; 2.主要粮食作物产业化湖北省协同创新中心, 湖北 荆州 434025; 3.无锡商业职业技术学院, 江苏 无锡 214153; 4.湖北民族学院生物科学与技术学院, 湖北 恩施 445000

拟青霉A20140822发酵生产虫草素工艺的响应面优化研究

郑 威1,2, 周迎红3, 刘金龙4*

1.湖北省农业科学院农业经济技术研究所, 武汉 430064; 2.主要粮食作物产业化湖北省协同创新中心, 湖北 荆州 434025; 3.无锡商业职业技术学院, 江苏 无锡 214153; 4.湖北民族学院生物科学与技术学院, 湖北 恩施 445000

用响应面分析法研究优化拟青霉A20140822发酵虫草素工艺。通过单因素试验找出影响发酵虫草素得率的主要因素。并按照响应面分析方法设计试验方案,分析得出影响虫草素得率的主要因素的最佳参数。拟青霉在温度21℃、时间38 h、维生素B1添加量0.08 g/L时，虫草素含量最高达到1.465 g/L。拟青霉A20140822发酵生产虫草素的量比已报道的拟青霉菌种高20%～50%,其发酵条件受温度、时间、维生素B1添加量等因素影响。

拟青霉A20140822；发酵；虫草素；响应面分析

冬虫夏草是我国特有的具有较高价值且被人们广泛认知的药食两用中药，虫草素是冬虫夏草的主要有效成分，具有抗肿瘤、提高免疫力、抗衰老和改善记忆等功能[1～6]。随着温室气体排放的增加，世界气候逐渐变暖，严寒环境区域日益缩小。再加上人类活动使得自然环境受到了毁灭性的打击，越来越多的原有环境发生了变迁或者破坏。这些都使得虫草的生长范围正在逐年缩小，但另一方面面对市场对虫草需求的日益增加，人们大肆进行不计后果的采摘也使得野生虫草供不应求。

菌丝发酵的冬虫夏草的主要成分和药效与野生虫草相似，有些成分含量甚至高于野生型,但其价格要低很多，对获得单一有效成分的生产有很重要的意义。拟青霉是国家药典认可的药食两用菌，可用来生产药品和保健品，藏虫草是冬虫夏草中品质最好的品种。从藏虫草中分离的拟青霉A20140822是一种新菌种，发酵液中有效成分含量高，本研究旨在优化发酵工艺，从而为它的开发提供参考，以便形成更好的医药产品和保健功能品，提高人们的生活质量，形成新的经济增长点。

1 材料与方法

1.1 试验材料

拟青霉A20140822菌种：从西藏海拔4 500 m采得的冬虫夏草中分离获得。超净工作台SW-CJ-2FD(苏州净化)；恒温摇床HQL150B(中国科学院武汉仪器厂)；智能发酵罐(镇江东方生物工程设备技术公司)。葡萄糖、 硫酸二氢钾、硫酸镁、蛋白胨、 酵母浸膏、 氨基酸、维生素B1、虫草素标准品均为国药化学试剂。

单因素实验培养基配方：小米100 g，葡萄糖10 g，白糖10 g，磷酸二氢钾0.5 g，硫酸镁0.25 g，蛋白胨2 g，酵母浸膏1.5 g，氨基酸0.15 g，维生素B10.1 g，pH 6.0，加超纯水定容至1 000 mL分瓶灌装。

维生素B1添加量单因素培养基配方：培养基其他成分不变仅改变维生素的加入量。加入量从0～0.22 g/L每增加0.02 g/L设置1个浓度处理，共设置12个梯度。

1.2 试验方法

1.2.1冬虫夏草菌的制备 取海拔4 000～5 000 m生长的天然冬虫夏草用泥土包裹好放置在4℃冰箱保存，分离前先用自来水冲洗5 min，75%酒精冲洗3 min，再用升汞处理4 min，无菌水冲洗3次后用灭菌后的手术刀将僵虫和子座切开分别处理。仔细去除表皮后将中间白色菌丝分切成3～5 mm的小段。用灭菌后的镊子将切分好的片段一半插到加有硫酸链霉素的分离培养基中。用封口膜将培养基封住，18℃黑暗培养7 d。

定期观察，将生长出的拟青霉A20140822挑到无菌水中稀释成若干个梯度涂布在培养皿中。黑暗培养定期观察，将单一的菌落再次转接，直到分离出单一菌种。将分离到的单一菌种用试管斜面保藏后镜检。

1.2.2单因素试验设计 将拟青霉A20140822接入培养基中，摇床培养待瓶内出现大量白色菌丝球为止。

①培养时间因素实验。配制12瓶实验培养基，每瓶100 mL，在超净工作台上接入10 mL种子培养液，选取26～48 h每隔2 h设置1个时间梯度在恒定条件下培养，设定罐压0.04～0.05 MPa，罐温20±2℃，pH 6.0,溶氧60%～100%，搅拌速度190 r/min。取出发酵液测定虫草素含量。

②培养温度因素实验。配制12瓶实验培养基，每瓶100 mL在超净工作台上接入10 mL种子培养液，分别在17～28℃之间每1℃设置1个温度梯度在恒定条件下培养，设定罐压0.04～0.05 MPa，pH 6.0,溶氧60%～100%，搅拌速度190 r/min，40 h后取出发酵液测定虫草素含量。

③维生素B1添加量因素实验。配制不同维生素B1浓度(从0～0.22 g/L设置12个梯度)添加量培养基各100 mL在250 mL三角瓶中，设定罐压0.04～0.05 MPa，罐温20±2℃，pH 6.0,溶氧60%～100%，搅拌速度190 r/min，40 h后取出发酵液测定发酵液中虫草素的含量。

1.2.3响应面试验设计 根据单因素试验结果设计响应面试验。根据Box-Behnken试验设计方案，选取维生素B1添加量(X1)、温度(X2)、发酵时间(X3)3个影响因子，虫草素得率为响应值，试验设计见表1。

采用SAS软件对15组试验数据进行多项拟合回归分析，可以得到维生素B1添加量、温度、发酵时间对虫草素得率的多元二次回归方程。

1.2.4虫草素检测 将发酵产物55℃温和烘干，粉碎，万分之一天平称取0.250 0±0.000 1 g，放入带盖玻璃瓶中，放入超声波清洗器中超声20 min。再将其移入微波炉中火处理100 s，得到虫草素待测样品。本试验冬虫夏草虫草素含量检测方法选用的浓度为1.8×10-4～12.6×10-4mol/L，虫草素的浓度与吸光度基本保持线性关系。利用虫草素标准品在260 nm的最大吸收波长下，得到虫草素吸光度与虫草素含量之间的标准回归方程。再利用分光光度计测定样品的吸光度，代入回归方程得到虫草素含量[7]。

表1 BOX-Behnken试验设计Table 1 BOX-Behnken experimental design.

①虫草素标准溶液的测定：精确称取经过烘干的虫草素标准品置于500 mL容量瓶中，纯化水定容，摇匀。分别取配制好的虫草素标准溶液1.8×10-4mol/L、3.6×10-4mol/L、5.4×10-4mol/L、7.2×10-4mol/L、9.0×10-4mol/L、10.8×10-4mol/L、12.6×10-4mol/L 2.0 mL置于260 nm处测定吸光度值(以2.0 mL蒸馏水为空白)得到虫草素浓度与吸光度的关系如图1。得到回归方程：Y=0.007 52X+0.191 57。

图1 标准虫草素的吸光度回归方程Fig.1 Absorbance regression equation of standard cordycepin.

②虫草素含量测定：吸取样品液2.0 mL(空白管为同样处理的未发酵的培养基2.0 mL)调节温度至室温置于260 nm处测定吸光度。

③虫草素含量的计算：将待测发酵液沉淀后取上清液，用纯化水梯度稀释到测得OD值在规定范围内,然后用分光光度计测出待测品的OD值，将OD值代入回归方程中，计算出虫草素摩尔浓度。再代入下列公式计算：

虫草素含量(g/L)=NMrX。

其中，N为稀释倍数，Mr为虫草素相对分子质量251.24，X为通过标准回归方程计算出的虫草素摩尔浓度。

2 结果与分析

2.1 拟青霉A20140822单因素实验

2.1.1发酵时间对虫草素产量的影响 通过对拟青霉A20140822菌持续发酵，通过虫草素的摩尔浓度的测定探究时间与虫草素产量的关系。对检测结果进行非线性拟合得到图2。如图2所示，拟青霉A20140822菌随发酵时间延长，在32～44 h范围内虫草素含量不断上升，发酵时间超过44 h后虫草素由于被细胞代谢，含量呈下降趋势。

图2 发酵时间对拟青霉A20140822虫草素产量影响Fig.2 Effect of fermentation time on the yield of cordycepin by fermentation of P. varioti A20140822.

2.1.2温度对产虫草素产量的影响 选取17～28℃温度条件下发酵40 h，探讨温度变量对拟青霉A20140822菌丝发酵液所产虫草素含量效果的影响。对发酵后产物中的虫草素摩尔浓度和温度进行非线性拟合。如图3所示，在18～23℃范围内随温度提高，虫草素含量不断上升，在22～24℃范围内出现最大值，在23℃后产量逐渐下降。拟青霉A20140822菌最适温度在20～25℃之间。

图3 温度对拟青霉A20140822发酵液产虫草素效果的影响Fig.3 Effect of temperature on the production of cordycepin by fermentation of P. varioti A20140822.

2.1.3维生素B1添加量对虫草素产量的影响 将拟青霉A20140822接入到维生素B1加入量因素培养基中在相同条件(20℃，40 h)通过测定虫草素的摩尔浓度，分析维生素B1加入量对拟青霉A20140822发酵液虫草素含量的影响。将上述检测结果做非线性拟合得到图4。

图4 培养基中维生素B1添加量对拟青霉发酵产虫草素的影响Fig.4 Effects of vitamin B1 content in culture medium on the production of cordycepin by the fermentation of the P. varioti A20140822.

如图4所示，随着培养基中维生素B1添加量从0.02 g/L增加到0.12 g/L虫草素的含量呈直线上升趋势,但超过0.12 g/L之后虫草素含量又减少。维生素B1添加量对拟青霉A20140822发酵产虫草素有影响，维生素B1添加量在(0.1±0.02)g/L时拟青霉A20140822菌丝发酵液虫草素含量比较高。

2.2 响应面法优化试验结果

选取培养基维生素B1添加量(X1)、发酵温度(X2)、发酵时间(X3)3个影响因子，虫草素得率为响应值，可得到试验结果如表3。表3结果表明，在发酵时间为38 h，发酵温度为21℃，维生素B1添加量在0.1 g/L时，虫草素得率最高为1.238 g/L。

表2 拟青霉A20140822响应面发酵产虫草素含量Table 2 Cordycepin content by the response surface fermentation of P. varioti A20140822.

运用SAS软件对15组试验数据进行多项拟合回归分析，可以得到维生素B1添加量、发酵温度、发酵时间对冬虫夏草拟青霉发酵液虫草素含量影响的多元二次回归方程：

Y=0.283 000-0.177 375X1-0.200 125X2-0.147X3+0.255 375X12+0.440 875X22+0.148 625X32-0.116 250X1X2-0.078 000X1X3+0.010 500X2X3

表3 拟青霉A20140822菌丝发酵生产虫草素回归模型方差分析结果Table 3 Regression analysis of P. varioti A20140822 fermentation producting cordycepin.

对回归方程显著性及3个单因素因子对拟青霉A20140822虫草菌丝发酵生产虫草素的影响进行检验，对数学模型进行方差分析。结果(表4)表明，模型F为112.098 7，P<0.000 1，表明该模型极显著；对模型进行适合性检验，P>0.05，未达到显著水平，表明该模型是稳定的，能较好地预测结果。

回归模型中X1、X2、X3影响极显著，且3个因素对虫草素产量的影响大小顺序为：发酵温度(X2)>维生素B1添加量(X1)>发酵时间(X3)。

交互项X1X2影响极显著，X1X3影响显著，X2X3影响不显著，显著顺序为X1X2>X1X3>X2X3。

二次项X12、X22、X32均表现有极显著影响，3个二次项的显著顺序为X22>X12>X32。

从响应面图5(彩图见图版二)可以看出响应值与影响因素的关系。等高线的形状可反映出交互效应的强弱，图形的焦点距离越远影响越明显。3个交互项的响应值对应图中的凹度和等高线图焦点的重合率表明X1X2>X1X3>X2X3，与方差分析结果一致。

对X1、X2、X3各设置5个水平，即X1为-1(0.08 g/L)、-0.5(0.09 g/L)、0(0.10 g/L)、0.5(0.11 g/L)、1(0.12 g/L)，X2为-1(21℃)、-0.5(21.5℃)、0(22℃)、0.5(22.5℃)、1(23℃)，X2为-1(38 h)、-0.5(39 h)、0(40 h)、0.5(41 h)、1(42 h)，进行3因素5水平设计，共25种组合，代入方程进行检验，得到不同组合虫草素含量如表5。由表5可知，此时的最优组合为-1、-1、-1，虫草素含量为1.465 g/L，而3因素3水平设计的最优组合为0、-1、-1，虫草素含量为1.238 g/L，与3因素5水平设计时0、-1、-1组合的虫草素含量为1.234 g/L只相差0.004 g/L，差异不显著。说明方程有很好的重现性，从而得出最优发酵工艺参数为发酵时间38 h，发酵温度21℃，维生素B1添加量0.08 g/L。

3 讨论

研究运用响应面法优化拟青霉A20140822发酵工艺，经试验优化后的拟青霉A20140822发酵生产虫草素的最佳工艺条件为：在发酵时间38 h条件下，拟青霉发酵温度为21℃，维生素B1添加量0.08 g/L,其模型最优产虫草素达1.465 g/L。各因素对拟青霉A20 140822发酵生产虫草素的影响分别为：发酵温度>维生素B1添加量>发酵时间。

图5 发酵时间、发酵温度和培养基维生素B1添加量对拟青霉A20140822菌丝发酵液中虫草素含量影响的响应面分析结果Fig.5 Response surface analysis of the effect of fermentation temperature, time and the amount of VB1 on cordycepin content.A:发酵时间40 h,维生素B1添加量和发酵温度对拟青霉A20140822菌丝发酵液中虫草素产量影响； B:发酵温度22℃,维生素B1添加量和发酵时间对拟青霉A20140822菌丝发酵液中虫草素产量影响；C：培养基维生素B1添加量0.1 g/L，温度和发酵时间对拟青霉A20140822菌丝发酵液中虫草素产量影响。(彩图见图版二)

表4 拟青霉A20140822发酵条件响应面优化分析结果Table 4 Response surface optimization analysis results of P. varioti A20140822 fermentation condition.

拟青霉A20140822虫草菌是从藏虫草中筛选出的一株新的国家有关部门鉴定保藏的菌株，也是药典认可的可生产药品、饮食品的药食两用菌。本研究生产虫草素的能力比已报道的拟青霉菌种高20%～50%。但试验只就发酵温度、发酵时间、维生素B1添加量对拟青霉A20140822产虫草素的影响进行了研究，在今后应对其他的发酵工艺参数，如培养基成分、接种量、摇瓶转速、pH等因素进行优化，以期获得最优的发酵培养体系，满足工业化生产的要求，同时对菌丝体中其他有效成分的最大获得量开展研究[8,9]。

目前，已经发现冬虫夏草中存在多种真菌并能竞争性生长，并成功分离出多种真菌，如蝙蝠蛾被孢霉、蝙蝠蛾拟青霉、虫草多毛孢、中国拟青霉、中国弯颈霉、中国被毛孢等[10～13]，蝙蝠蛾拟青霉是竞争性优势较强的一种真菌，蝙蝠蛾拟青霉菌丝体与冬虫夏草的化学成分指纹谱极为相似[14]。如何利用这些真菌发酵工业化生产菌丝体已成为现阶段人们研究的重点。

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ResponseSurfaceOptimizationoftheFermentationProcessofCordycepinbyPaecilomycesvariotiA20140822

ZHENG Wei1,2, ZHOU Yinghong3, LIU Jinlong4*

1.InstituteofAgriculturalEconomicandTechnology,HubeiAcademyofAgriculturalScience,Wuhan430064,China; 2.HubeiCollaborativeInnovationCenterforGrainIndustry,HubeiJingzhou434025,China; 3.WuxiVocationalInstitueofCommerce,JiangsuWuxi214153,China; 4.CollegeofBiologicalScientificandTechnical,HubeiMinzuUniversity,HubeiEnshi445000,China

Response surface analysis method was used to study the optimization of the fermentation process of cordycepin byPaecilomycesvariotiA20140822. The main factors affecting the yield of fermented cordyceps were found out through single factor experiment. According to the response surface analysis method, we obtained the optimal parameters. The content of cordycepin was the highest 1.465 g/L at the vitamin B10.08 g/L, time 38 h and temperature 21℃. The fermentation condition of A20140822 was 20%～50% higher than that of the fungus. The fermentation conditions were affected by the factors such as temperature, time and vitamin B1content.

PaecilomycesvariotiA20140822; fermentation; cordycepin; response surface analysis

2017-10-03;接受日期2017-10-18

湖北省科技支撑计划项目(2015BBA178);湖北省富硒产业发展专项(XKJ201501-17;XKJ201501-20)资助。

郑 威,研究员,博士,主要从事富硒技术研究及功能产品研发。E-mail:nkyzhengwei@163.com。*通信作者：刘金龙,高级实验师,主要从事富硒生物工程教学与研究。E-mail:liujl1618@163.com

10.19586/j.2095-2341.2017.0146