纳豆激酶分离纯化研究进展

黄妍，张勋力，张迎庆*

1(湖北工业大学 生物工程与食品学院，湖北 武汉，430068)2(北京纳百恩食品有限公司，北京，102200)

纳豆激酶分离纯化研究进展

黄妍1，张勋力2，张迎庆1*

1(湖北工业大学 生物工程与食品学院，湖北 武汉，430068)2(北京纳百恩食品有限公司，北京，102200)

纳豆激酶是枯草芽孢杆菌发酵过程中产生的一种碱性蛋白酶，具有较强的溶栓作用。与其他溶栓剂相比，纳豆激酶易被吸收，作用迅速，安全性好，可做为新型溶栓剂。文中概述了纳豆激酶的理化性质和作用机制，着重介绍了纳豆激酶的几种常见的分离纯化方法，包括柱层析法、超滤法、萃取法和亲和颗粒法，以及集成化分离纯化技术，并对纳豆激酶分离纯化的新方法进行了展望，以促进纳豆激酶的深入开发和应用。

纳豆激酶；分离纯化；亲和；吸附

纳豆，起源于中国古代，是一种历史悠久的风味食品。纳豆一般的制作工艺是将精选的大豆洗干净，浸泡一段时间，然后煮熟、摊凉，接种纳豆芽孢杆菌，发酵一段时间即可得到成熟纳豆[1]。

研究发现，纳豆的营养丰富，在发酵过程中不仅没有损坏黄豆的营养，还产生了许多具有生物活性的物质,包括：纳豆激酶、VK2、γ-多聚谷氨酸、环脂肽、2，6-吡啶二羧酸等[2]。这些活性物质在帮助蛋白质吸收的同时，还使纳豆具有溶血栓、降血脂、降血压、防止骨质疏松、消除疲劳、抗菌消毒、抗氧化、延缓衰老的功能[3-4]，而其中研究最多的是具有溶栓作用的纳豆激酶，高活性的纳豆激酶提取分离纯化技术又是其深入开发应用的关键，本文主要就纳豆激酶的分离纯化方法的研究进展进行综述。

1 纳豆激酶的性质及溶栓机制

1.1 纳豆激酶的性质特点

纳豆激酶是纳豆在发酵过程中产生的一种碱性丝氨酸蛋白酶，由275个氨基酸残基组成，分子质量为27.7 ku，等电点pI值为8.6[5]。虽然纳豆激酶与丝氨酸蛋白家族的许多枯草杆菌蛋白酶的序列相似，并且具有高度的同源性，但是对底物表现出了明显的特异性[6]。

纳豆激酶比较稳定，在pH 6～12时表现了出较好的纤溶活性，但在酸性环境中由于缺乏功能和结构的稳定性而无活性。因此有研究者为防止含有纳豆激酶的口服药物被胃液破坏，将丙烯酸树脂L 100-55和羟丙基纤维素混合制成肠溶衣包裹在纳豆激酶片剂表面，来控制纳豆激酶药物在体内的释放速率[7]。

随着温度的升高，纳豆激酶的活性逐渐降低，到60 ℃彻底失活。为减小温度对纳豆激酶稳定性的影响，有研究者发现采用γ-聚谷氨酸作为纳豆激酶微胶囊的涂层材料后可提高纳豆激酶对温度和pH的稳定性[8]。经过5次反复冻融，纳豆激酶的活性仍可以保持在95%以上，表明冻融对纳豆激酶的活性影响不大[9]。

1.2 纳豆激酶的溶栓作用机制

血栓疾病是严重威胁人类生命健康的疾病，因此溶栓药物的研究受到了广泛的关注。纳豆激酶是纳豆发酵产生的活性物质之一，而溶解血栓是其最重要的活性。

纳豆激酶在体内还是体外都有纤溶活性，不仅可以直接溶解纤维蛋白，而且可以促进细胞释放组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)，激活组织型纤溶酶来降解纤维蛋白[10]。此外纳豆激酶还能激活产生纤溶酶原来增加内源纤溶酶，催化尿激酶原转化成尿激酶来促进纤维蛋白的溶解。虽然纳豆激酶对纤维蛋白原不敏感，但是对交联纤维蛋白裂解起有效促进作用，并且能使纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)失活，通过阻止血栓素形成来抑制血小板的聚集[11]。

在血液中纳豆激酶的纤溶活性能保持3 h以上[12]，降低血浆中的纤维蛋白原、凝血因子VII和凝血因子VIII的含量是纳豆激酶的另一个特点，因此，纳豆激酶可作为治疗心血管疾病的药物或营养品[13]，并且有安全、高效、经济的特点，也是溶栓药物的研究重点[14]。

2 纳豆激酶的提取纯化方法

目前工业化生产纳豆激酶主要从纳豆芽孢杆菌的发酵液中提取，纳豆激酶是胞外酶，将其发酵液经过一系列分离纯化处理即可得到纳豆激酶。然而发酵液成分复杂，纳豆激酶并不能在其中稳定存在，容易由于其存在环境的过酸、过碱或高温等极端条件而失活。因此在纯化纳豆激酶的同时要保证其活性，常常需要多步操作。

2.1 柱层析法

由于生物大分子对分离纯化的条件比较严格，大部分采用的都是传统的蛋白质分离纯化的方法，即色谱分离技术，也称柱层析法。柱层析法纯化或回收蛋白酶时通常涉及到几个步骤，包括硫酸铵或有机溶剂沉淀、过滤或离心、透析等，然后进行色谱分离，例如离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水作用层析和亲和层析。最后得到的滤液再进行浓缩、冷冻干燥。一般可将凝胶层析、亲和层析、疏水层析和离子交换层析中的一种单独使用，也可将两种以上的层析方法配合使用。

近年来，部分研究者采用柱层析法分离纳豆激酶的研究成果见表1。

表1 柱层析法分离纳豆激酶的部分研究成果Table 1 Research on separation of nattokinase by column chromatography

柱层析法在纳豆激酶的分离纯化方面应用广泛，虽然可以得到较高的回收率，但也存在着一些缺点，比如成本高、操作复杂、消耗时间长且不易于放大用于工业生产，并且当利用有机溶剂沉淀杂蛋白时，也极易使蛋白变性失活。因此为保证得到的纯化酶具有较高的催化活性，就需要找到提取条件温和、操作过程简单、成本不高的分离纯化技术，应用于工业生产。

2.2 超滤法

超滤技术的核心部分为具有微小孔径的超滤膜。超滤膜可以将流经其表面，大于其孔径的分子截留，小于其孔径的分子则透过，从而达到浓缩大分子的目的。这种方法虽然不会对酶活力有损害，但单独使用得到的酶纯度不高，因此多与其他方法联用。

陈景鑫等[23]将超滤法和层析法联用，先使用超滤法处理实验室制备的纳豆激酶粗酶液，探究了超滤压力、超滤温度、料液pH值等主要参数对膜通量的影响，确定了超滤分离纳豆激酶的最佳工艺条件后，再用层析法分离得到纳豆激酶的比活力为9 610.46 IU/mg、回收率为92.3%，酶液经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳表现为单一蛋白条带，相对分子质量为28 000 u。

MURAKAMI等[24]将纳豆激酶发酵液离心除菌后使用反渗透膜处理，再将滤液通过截流分子质量为10 ku的超滤膜除去小分子量杂质，之后使用CM-琼脂凝胶柱洗脱，得到的较高活性的滤液经超滤设备进一步浓缩，再次用凝胶柱S-100过滤后，经12 000 r/min离心得到纯化度较高的纳豆激酶。因此若将超滤技术代替盐析法进行发酵液的前处理，再上色谱柱进一步纯化滤液得到的纳豆激酶活性很可能较盐析法高，且方法可行。但是盐析操作也有一定的优点，一定浓度的盐溶液在沉淀杂蛋白的同时，也可以去除一定量的离子，既可以减少大分子堵塞滤膜的概率，又能降低杂离子对离子交换柱的吸附影响。王建[25]先将发酵液用盐析法进行前处理，再根据纳豆激酶的分子量选用不同孔径的超滤膜纯化纳豆激酶。选用30%饱和度的硫酸铵沉淀杂蛋白，再用70%饱和度的硫酸铵沉淀纳豆激酶，根据纳豆激酶的分子量，将纳豆激酶的粗酶液经30 ku的超滤膜过滤，并将透过的溶液收集再经10 ku的超滤膜，收集没有透过膜的滤液。通过单因素实验和正交实验研究了操作压力、料液温度和料液pH值等超滤工艺参数对膜通量和纳豆激酶含量的影响，最后分离纯化得到的纳豆激酶比活力达到1 052.41 IU/mg，纯化倍数为2.5，回收率达到81%。与仅用硫酸铵盐析法分离纯化纳豆激酶相比较，虽然进一步使用超滤法提纯后回收率有所下降，但纳豆激酶的纯化倍数得到很大提高，并且超滤法步骤比较简单,对纳豆激酶的含量也不会有特别大的损失。蔡立涛与黄婷[26-27]等都将发酵液经过盐析法将杂蛋白进行初步除杂后再经超滤法过滤，得到的混合液经SDS-PAGE,显示的分子质量约为27 000 u左右，纤溶蛋白平板显示结果具有较好的纤溶活性。因此可以得出盐析与超滤法联用可以取得活性较好，回收率较高的纳豆激酶。

2.3 萃取法

传统的萃取法用到的有机溶剂易破坏蛋白质的生物活性，所以用萃取法分离纯化生物大分子时，使用最多的为双水相萃取法以及反胶团萃取法。

双水相萃取法是一种行之有效的液液萃取的分离方法，在纯化目标蛋白时能同时去除杂质，达到短时间浓缩的目的。当水溶液中含有两种聚合物/聚合物或聚合物/盐时，若这些成分浓度达到一定的临界值，两种成分之间因互不相容而分离，形成两相，即双水相系统。双水相系统利用生物大分子在两相之间的溶解度不同而将目标分子分离，具有生物相容性，因此当外界条件不变时，纳豆激酶能稳定存在其中，不会破坏酶的活性。并且双水相系统能耗低，不会对环境造成太大污染，也方便放大。

YANG等研究了PFG400/(NH4)2SO4和PEG6000/ MgSO4两种双水相系统提取纳豆激酶，研究最适提取条件。结果表明，和PEG6000/MgSO4双水相系统相比，PFG400/(NH4)SO4双水相系统更适合提取纳豆激酶，当PFG400占体系的24%，(NH4)SO4占27%，纳豆激酶粗酶液占15%时，提取效果最好，纳豆激酶纯化因子达2.11。这种方法虽然可以将水溶性聚合物和盐回收再利用，但是仍然成本较高，选择性较低，只适合用于粗分离。

由于纳豆激酶的氨基酸序列中存在-His-Gly-Thr-His-结构，还可以利用二价或三价金属离子对该结构的螯合亲和作用,将金属粒子引入双水相系统中分离纳豆激酶。陆瑾等[28]利用金属螯合亲和水相分配技术对纳豆激酶的分离纯化进行了研究，结果表明，双聚合物系统比聚合物/无机盐系统更有利于纳豆激酶亲和分配，pH值和亲和配基加入量是影响分配的关键因素。优化条件为:聚乙二醇质量分数为2.6%，羟丙基淀粉质量分数为20.2%，亲和配基PEG-IDA-Cu(II)质量分数为5%，相比1.2，pH 8.2，发酵液加入量质量分数15%。分配系统放大到100 g，仍保持酶活收率为90%和纯化因子为2.0。金属螯合亲和萃取的选择性取决于能与目标蛋白氨基酸结合的基团或金属离子，并且这种结合作用不受高盐浓度的影响，但是对于那些容易被金属离子引起变性的酶的实用性不高。

反胶团萃取是在非极性溶液中加入表面活性剂，使表面活性剂分子在溶液中形成外部疏水，内部亲水的微球，这些微球将目标蛋白酶包裹在微球内部，使蛋白酶避免与有机溶剂接触而保障了蛋白酶的活性，将这些微球转入水相后即完成了生物分子的分离。LIU等[29]利用同源蛋白质的氨基酸序列具有明显的相似性的特点，从模拟系统入手，研究从发酵液中提取目标蛋白的方法。由于纳豆激酶和Subtilisin Carlsberg为同源蛋白，以Subtilisin Carlsberg为模拟蛋白，以AOT/isooctane反胶团体系为有机相，研究了各种萃取条件和反萃取条件对Subtilisin Carlsberg萃取过程的影响，并利用AOT/isooctane反胶团体系从发酵液中分离纯化纳豆激酶。结果表明，纳豆激酶的萃取行为和Subtilisin Carlsberg非常类似，证明以目标蛋白的同源蛋白作为模拟蛋白研究萃取规律是可行的，经过一次萃取循环，纳豆激酶的回收率为33.25%，酶活回收率达到80.2%，纯化因子为2.5左右。这种模拟系统萃取目标蛋白的方法大大减小了直接萃取目标蛋白的难度，并且与传统的萃取方法相比选择性高、成本不高、操作也较为简单。

三相分配技术是一项相对较新的技术，不同于双水相系统，该技术可以从发酵液中直接提取目标蛋白，并将混合液分为3层，上层为有机相，下层为水相，非极性有机相与极性水相之间则为目标蛋白的富集区。三相分配技术具有简单、快速、高效的特点，并且易于放大用于工业生产。ROMY等[30]利用三相分配技术从纳豆激酶发酵液中分离纳豆激酶，采用硫酸钠和叔丁醇组合沉淀粗蛋白，使目标蛋白存在于下层水层和上层有机层之间的界面。他们研究了温度、pH、硫酸铵和叔丁醇的浓度等关键参数，发现pH 8，温度37 ℃，硫酸铵质量浓度为30%，并且和叔丁醇的比例为1∶1.5最为合适。一次三相分离，纯化倍数为5.6，酶活回收率为129.5%。纳豆激酶用不同的辅料冻干，同时采用叔丁醇(助溶剂)冷冻干燥，其二级结构没有影响。三相分离技术使用的叔丁醇与沉淀的蛋白结合，增加了蛋白的浮力，使沉淀蛋白浮于浓盐溶液之上，因此相较于其他分离纯化方法具有条件温和以及成本低等优点，既保证了酶的活性不受影响，回收率也较高。

2.4 亲和颗粒

亲和颗粒提取生物大分子取决于与特定靶分子之间相互作用的亲和配体。近年来，制备亲和颗粒吸附剂，利用其对纳豆激酶的亲和性，在纳豆激酶的粗酶液中亲和吸附纳豆激酶，是提取纯化纳豆激酶的又一新兴方法。

早在2006年，YANG等[31]制备了大小均一，用氨基修饰的PMMA磁性微球，并将对氨基甲苯脒作为亲和配体固定于微球表面，最后得到的磁性微球可以在发酵液中直接纯化纳豆激酶，并且纯化倍数和酶活回收率分别为8.7和85%，纯化过程仅需40 min。由于这种方法和传统方法相比不仅节省纯化时间，较大程度上简化了选择过程，还提供了较好的结果，于是越来越多研究者倾向于制备亲和颗粒来纯化纳豆激酶。2011年，苏俊彩等[32]利用大豆蛋白对纳豆激酶有吸附作用，通过反相悬浮聚合法制得了壳聚糖微球，并在它表面上交联上大豆蛋白，制得的壳聚糖微球成为亲和吸附剂，对纳豆激酶具有特异性吸附性能，测得的吸附平衡时间为60 min，回收率为5.23%，纯化因子为18.1。2012年，马跃华等[33]采用静态吸附方法验证了大豆颗粒对纳豆激酶的亲和吸附特性，测定了其静态吸附动力学特性和吸附等温线以及吸附条件。结果表明吸附的最佳缓冲液选择pH 6.0，0.01 mol/L的PBS，吸附时间4 h，浓度为1 mol/L的NaCl溶液进行洗脱，在静态时，选用大豆颗粒的最大吸附量为6 351.58 IU/g，洗脱后收率达到81.3%，纯化倍数约30.23倍，并且电泳检测可达到一条带。因此他们初步推断大豆蛋白之所以可以吸附纳豆激酶，是因为大豆蛋白中可能含有与纳豆激酶特异性吸附的配体结构。

随着制备亲和吸附剂方法的发展，也有研究者用化学合成的方法制备了易于与混合液分离的亲和吸附颗粒。KONG等[34]采用改进悬浮聚合法制备了磁性聚醋酸乙烯酯微球，经水解、氨基化修饰，以戊二醛作间隔臂偶联配基对氨基苯甲脒，制得磁性PVA亲和微球，用于纳豆激酶粗酶液的分离纯化，结果表明，磁性微球具有较高的比饱和磁化强度，40 min即可达到纳豆激酶的吸附平衡，15 min内完成酶的解吸，酶活回收率接近75%，电泳分析为一条带。2017年，LIU等[35]用二咪唑为交联剂，DMSO作溶剂，将精氨酸或赖氨酸修饰在磁性纳米颗粒表面，用来吸附纳豆激酶，并用茚三酮法检测吸附结果。研究结果表明，精氨酸修饰的磁性纳米颗粒对纳豆激酶的吸附量为所及表面修饰的4倍。精氨酸表面修饰的磁性纳米粒子对纳豆激酶的吸附量在9.6～30 mol/mg，可以有效分离纳豆溶液中的纳豆激酶。制备亲和颗粒可以在发酵液中直接吸附目标蛋白而达到分离纯化的目的，操作简单，效率高，不会对蛋白活性有任何不良的影响，更易于分离，是一种理想的分离纯化方法。

2.5 集成化分离纯化法

分离技术的集成化是利用已有的和新开发的生物技术，将下游过程的有关单元进行有效组合，或者将两种以上的分离技术合成为一种更有效的分离技术，达到提高产品收率、降低过程能耗和增加生产效益的目标。

膨胀床分离是一种集成化分离技术，可直接从未经固液分离的发酵液中吸附目标蛋白，将固液分离、目标产物的浓缩和初步纯化集成于一个单元操作中，避免了复杂的纯化步骤使纳豆激酶失活的缺点，提高了产品回收率，可用于快速分离纯化。胡洪波等[36]对膨胀床分离纳豆激酶过程的各个阶段进行了考察。填充床上的探索性实验表明，吸附时最佳的pH为6，电导率应低于6.2 ms/cm。与传统法相比，用膨胀床对纳豆激酶进行分离和纯化，操作步骤从离心去除菌体、盐析沉淀、离心收集沉淀、溶解沉淀、离心收集上清液和离子交换层析6步减少到离心、膨胀床分离2步，操作时间缩短了8～10 h，回收率提高了约50%。充分体现了分离过程集成的优势。

3 展望

在纳豆激酶分离纯化过程中，大部分研究都采用了两种或两种以上的操作步骤，例如过滤、盐析沉淀、透析、超滤、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和作用、疏水作用等。超滤是常用的浓缩方法，但有比较广泛的透过率和滤膜易被污染的缺点。色谱分离法，需要进行前处理，消耗较多的时间，一般用于治疗性蛋白，不能应用于大规模生产；而通常的萃取法得到的纳豆激酶纯度也不高。因此即使含有纳豆激酶的产品廉价易得产量高[37]，但纳豆激酶的纯品却不多见。随着分离纯化技术的不断发展，新型的分离纯化技术在生物制品上的应用上也越来越广泛。文中所讨论的亲和颗粒的方法不仅对纳豆激酶具有特异性，还可以直接在混合液体中直接吸附纳豆激酶，而且易于与原混合液分离。近年来不断发展起来的分子印迹技术[38]与该方法有同工之妙，只需根据不同模板分子的大小、理化性质及空间结构特点，制备对模板分子具有特异性吸附作用的印迹聚合物，用该聚合物吸附特定的模板分子，对小分子或绝大多数的生物大分子都适用，且不会破坏其生物活性，具有操作简便，精度高，耗时短的优点。技术的发展日新月异，待更多的分离纯化技术成熟，有望投入大规模分离生产，获得更多高质量、高纯度的纳豆激酶产品指日可待。

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AdvanceonisolationandpurificationofNattokinase

HUANG Yan1,ZHANG Xun-li2,ZHANG Ying-qing1*

1(Food and Bioengineering College,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China) 2 (Beijing NABIO Food Limited Company,Beijing 102200,China)

Nattokinase with strong thrombolytic effect is a kind of serine protease produced byBacillussubtilis.Compared with other thrombolytic agents,nattokinase is easy to be absorbed and has a rapid effect and good safety.Therefore,it is a new thrombolytic agent to be developed.The mechanism and physicochemical properties of Nattokinase were summarized herein.Several methods for isolation and purification of nattokinase were introduced,including column chromatography,ultrafiltration,extraction and affinity particle adsorption,as well as integrated separation and purification technology.The new method for isolation and purification of nattokinase was prospected to improve the development and application of Nattokinase.

Nattokinase; isolation and purification; affinity; adsorption

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.015373

硕士研究生(张迎庆教授为通讯作者，E-mail：ying qingzhang@163.com)。

2017-08-04，改回日期：2017-08-25