刺梨自然发酵后抗氧化物质含量与抗氧化活性分析

（贵州大学，贵州贵阳550025）

刺梨自然发酵后抗氧化物质含量与抗氧化活性分析

熊巧仪，刘丁群，鲁敏

（贵州大学，贵州贵阳550025）

以刺梨果实与冰糖按3种比例（质量比1∶1，2∶1，4∶1）制作酵素，测定酵素及刺梨自然发酵后残余果实中维生素C（VC）、总酚、类黄酮、类胡萝卜素含量及超氧化物歧化酶（SOD）活力，同时采用超氧阴离子自由基（·O2－）、羟基自由基（·OH）和1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH·）体系分析体外抗氧化活性，并比较抗氧化物质与抗氧化活性之间的相关性。结果表明，果糖比1∶1制作的刺梨酵素中VC、总酚、SOD酶活性、·OH清除率与·O2－清除率最高，分别达到 1 519.31mg/100mL、60.65mg/mL、8 571.43 U/mL、78.69%和 98.66%，且 VC、总酚和 SOD 酶活性与·OH 及·O2－清除率呈显著到极显著正相关；果糖质量比4∶1自然发酵后残余果实中类胡萝卜素、类黄酮、总酚、·OH清除率与DPPH·清除率最高，分别为32.05mg/100 g、13.55mg/g、37.58mg/g、62.42%和95.33%，且类胡萝卜素、类黄酮和总酚均与·OH及DPPH·清除率呈显著到极显著正相关。不论在刺梨酵素中，还是在刺梨自然发酵后的残余果实中，总酚与·OH清除率始终存在极显著的正相关性

刺梨；酵素；抗氧化物质；抗氧化活性

酵素是一种功能性微生物发酵产品，通常以水果为原料，经过一种或多种有益菌发酵，含有丰富的酶、维生素、矿物质和次级代谢产物等营养成分，具有抗衰老、抗菌消炎、增强机体免疫力、修复机体损伤等功能[1]。在自然界中，酵母菌广泛存在于各种水果的表面，因此，自然水果酵素逐渐成为近年来的研究热点，如葡萄[2-3]、苹果[4]、蓝莓[5]等自然酵素；此外，还有木瓜[6]、冬枣[7]及火龙果[8]酵素。研究发现，不同水果酵素中起抗氧化作用的抗氧化物质种类存在一定差异。葡萄、苹果及蓝莓自然酵素在发酵过程中抗氧化性能总体呈现上升趋势，且抗氧化性与酚类物质变化相关性较大[2-5]。冬枣酵素在发酵过程中羟自由基清除率和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力均不断升高；黄酮含量发酵前后没有显著变化[7]。火龙果酵素具有很强的超氧阴离子自由基、羟自由基、DPPH自由基清除能力，酵素内SOD活力为300 U/mL，并且也有一定的淀粉酶和脂肪酶的活性[8]。

刺梨（Rosa roxburghii Tratt.）是我国特有果树资源，其果实富含维生素 C（VC）[9-10]、SOD[11]、类黄酮[12]、以及氨基酸[13]等多种营养物质而具有极高的营养、保健和医药价值[14-16]，但刺梨酵素的相关研究尚未见报道。刺梨酵素为刺梨果实自然发酵后的代谢产物，研究其抗氧化物质种类及含量、抗氧化性能以及两者之间的相关性可为刺梨酵素产品的有效开发提供理论基础。同时，与其他大多数水果不同，由于刺梨果实中富含膳食纤维[17]，制作酵素后的刺梨果实烘干后还可制成蜜饯、果干等产品，因此，本研究将测定刺梨酵素及刺梨自然发酵后残余果实的维生素C、总酚、类黄酮、类胡萝卜素含量及SOD活力，同时采用超氧阴离子自由基体系、羟基自由基体系和DPPH·体系3种自由基体系分析刺梨自然发酵后抗氧化物质含量与抗氧化活性，为进一步阐明刺梨酵素及相关产品的保健功能机理和综合性开发提供理论基础和技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

刺梨：采自贵州大学农学院园艺系刺梨种质资源圃；冰糖（一级品）：市购。

α，α-二苯基-β-苦苯肼（DPPH）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸草酸（EDTA）、2，6 二氯酚靛酚、福林酚、碳酸钠、乙醇、没食子酸、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、芦丁、邻苯三酚、盐酸、硫酸亚铁、水杨酸等试剂均为分析纯：赛兰博科技有限公司；双蒸水：贵州大学自制。

BS110S型电子天平：德国Sartorius公司；数显pH仪、Sorvall Stratos冷冻高速离心机：美国Thermo公司；KQ5200DE型数控超声清洗器：中国昆山市超声仪器有限公司；UV-2500紫外可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 刺梨酵素制作及自然发酵后残留果实的前处理

于2016年9月从贵州大学农学院园艺系刺梨种质资源圃中选择无病虫害，整齐一致的刺梨成熟果实，采后立即运回实验室。将刺梨去头去尾、去籽去刺，切 4块，与冰糖按不同质量比（1∶1、2∶1、4∶1）配制，密封后让其在黑暗条件下25℃自然发酵，3个月后得到刺梨酵素，同时将自然发酵后的残留果实烘干研磨后过65目筛，并取2.5 g于50mL有盖试管中，加入25mL含1%盐酸的乙醇溶液，于30℃摇床（100 r/min）浸提2 h，过滤后定容至50mL，用于后续试验。

1.2.2 维生素C的测定（2，6-二氯酚靛酚法）[18]

准确量取1mL样品，加入2%草酸溶液，定容至10mL，摇匀，备用。用已标定的2，6二氯酚靛酚溶液滴定至出现微红色且30 s内不褪色为止，记下染料的用量。同时。以10mL 20 g/L草酸溶液作为空白，按同样方法进行滴定，重复3次。

式中：V为待测液总体积，mL；V1为样品消耗体积，mL；V0为空白试剂消耗体积，mL；VS为滴定所取体积，mL；m为样品质量，mL；ρ为滴定液标定体积，mL。

1.2.3 总酚的测定（Folin-Denis法）[19]

取1mL样品于试管中，分别加入0.5mL福林酚，3mL 2%Na2CO3，室温下避光2 h后，以80%乙醇为对照。用紫外分光光度计测定765 nm的吸光值，计算总酚含量，以mg/mL的没食子酸为单位，得到没食子酸标准溶液浓度y与吸光度x的回归方程。按照上述方法制作，测其吸光值，并计算总酚含量，酵素样品中的总酚以没食子酸的含量（mg/mL）表示。

式中：C为没食子酸的浓度，（mg/mL）；V为溶液体积；n为稀释倍数；m为残留果实样品质量。

1.2.4 类黄酮的测定（亚硝酸钠-硝酸铝比色法）[12]

将1mL样品置于10mL容量瓶中，加入5%亚硝酸钠溶液0.3mL，摇匀后静置6min；加入10%硝酸铝溶液0.3mL，摇匀后静置6min；再加入4%氢氧化钠溶液4mL，摇匀；最后用蒸馏水稀释至刻度，静置15min，以试剂空白为参比，510 nm下测定吸光值。以芦丁为标准品，以芦丁浓度C（mg/mL）与其吸光值A的关系拟合标准曲线，根据标准曲线计算所测刺梨酵素样品溶液类黄酮的含量。

式中：C为类黄酮浓度，（mg/mL）；V为提取液定容体积，mL；v为测定液体积，mL；m为被测残留果实质量，g。

1.2.5 类胡萝卜素（比色法）[20]

取刺梨酵素（或刺梨发酵后残留果实样液）于440 nm比色测定吸光度，以蒸馏水为对照。

酵素中类胡萝卜素含量/（mg/mL）=A×20；残留果实样液中类胡萝卜素含量/（mg/100 g）=（A×20×V×100）/m

式中：A为吸光值；20为换算系数；V为提取液体积，L；m为被测残留果实质量，g。

1.2.6 SOD活性测定（邻苯三酚自氧化法）[11]

在试管中按表l加入缓冲液和双蒸水，于25℃恒温20min后加入25℃预热过的邻苯三酚（对照管用10 mmol/L盐酸代替），迅速摇匀，立即倾入比色杯中，在波长325 nm处每30 s测定一次吸光值A0。SOD活性测定法按下表1操作，加入邻苯三酚前，先加入0.5mL的不同浓度的刺梨酵素，并减少同体积双蒸水，其它操作均与上述相同，所测吸光值为ASOD。

表1 邻苯三酚自氧化速率测定加样表Table 1 Sample adding table of determining autoxidation rate of pyrogallic acid

式中：V1为反应液总体积，mL；V2为测定样品体积，mL；ΔA0为邻苯三酚的自氧化速率；ΔASOD为样品光密度值变化速率；n为稀释倍数。

1.2.7 对超氧阴离子自由基（·O2－）清除作用的测定[8]

取0.05 mol/L pH8.2的 Tris-HCl缓冲液 4.5mL，置于25℃水浴中预热20min，分别加入lmL不同浓度的酵素和0.4mL 25 mmol/L的邻苯三酚溶液，混匀后于25℃水浴中反应5min，加入8 mol/L HCl l.0mL终止反应，以Tris-HCl缓冲液作参比，在299 nm处测定吸光度，计算清除率。空白对照组以lmL试样溶剂代替样品。每个处理均做3个重复。

清除率的计算公式：

式中：A1为空白的吸光值；A2为样品的吸光值。

1.2.8 对羟基自由基（·OH）清除作用的测定[8]

·OH由Fenton反应产生，·OH氧化水杨酸产生对510 nm光有特征吸收的2，3-二羟基苯甲酸，通过测定水杨酸捕获·OH所得到的产物确定·OH的清除率。在试管中加入2 mmol/L FeS043mL、1 mmol/L H2O23mL，摇匀，接着加入6 mmol/L水杨酸3mL，摇匀，于37℃水浴加热15min后取出，测其吸光值A0。然后分别加入1mL不同浓度的样液，摇匀，继续水浴加热15min，取出测其吸光值AX。计算酵素液对·OH清除率。

式中：A0为空白的吸光值；AX为样品的吸光值。

1.2.9 对DPPH自由基清除作用的测定[8]

准确称取20 mgDPPH，用无水乙醇定容于250mL容量瓶中，得到浓度为20 mmol/L的DPPH溶液。取2mL样液及2mL的20 mmol/LDPPH混匀后反应30min，测定波长517 nm下吸光值的变化，对照溶剂用无水乙醇代替，按下式计算DPPH·清除率。

式中：Ai为DPPH液与样液的吸光值；Aj为无水乙醇与样液的吸光值；Ac为DPPH液与无水乙醇的吸光值。

1.3 数据分析

在Microsoft Excel 2003中对试验数据进行整理。采用DPSv7.05分析软件对数据进行差异显著性分析及相关性分析。

2 结果与讨论

2.1 刺梨自然发酵后酵素及残留果实中抗氧化物质含量

刺梨酵素抗氧化物质含量见表2。

刺梨果实与冰糖比例为4∶1制作刺梨酵素时，类胡萝卜素与类黄酮含量最高，分别为（166.73±7.39）mg/mL和（59.34±0.91）mg/mL，显著高于果糖质量比为 2∶1及1∶1的处理。而从VC、总酚和SOD酶活性来看，则果糖质量比1∶1制作的刺梨酵素含量最高，分别为（1 519.31±4.92）mg/100mL、（60.65±0.78）mg/mL 和（8 571.43±0.0）U/mL，其中 VC含量是4∶1处理的 19倍，SOD酶活性是4∶1处理的5倍，SOD酶活性比火龙果酵素高出28倍[8]。刺梨自然发酵后残留果实中抗氧化物质含量见表3。

表2 刺梨酵素抗氧化物质含量Table 2 The content of antioxidant substances in Rosa roxburghii natural ferment

表3 刺梨自然发酵后残留果实中抗氧化物质含量Table 3 The content of antioxidant substances in fruits after Rosa roxburghii natural fermentation

在刺梨自然发酵后残留果实中没有检测到VC及SOD酶活性，类胡萝卜素、类黄酮和总酚均以果糖质量比 4 ∶1 处理为最高，分别为（32.05±0.02）mg/100 g、（13.55±0.05）mg/g 和（37.58±0.02）mg/g，其中类黄酮含量是1∶1处理的8倍。

2.2 刺梨自然发酵后酵素及残留果实中抗氧化活性分析

刺梨酵素抗氧化活性见表4。

刺梨果实与冰糖比例为1∶1制作刺梨酵素时，·OH清除率与·O2-清除率最高，分别为78.69%和98.66%，显著高于果糖质量比为2∶1及4∶1的处理，其中·OH清除率约为2∶1及4∶1处理的3.5倍。3种果糖比处理对DPPH·清除率没有显著影响。刺梨自然发酵后残留果实抗氧化活性见表5。

表4 刺梨酵素抗氧化活性Table 4 The antioxidant activity in Rosa roxburghii natural ferment

表5 刺梨自然发酵后残留果实抗氧化活性Table 5 The antioxidant activity in fruits after Rosa roxburghii natural fermentation

在刺梨自然发酵后残留果实中·OH清除率与DPPH·清除率均以果糖质量比4∶1处理为最高，分别为62.42%和95.33%，而·O2-清除率则以果糖比2∶1显著高于其它2个处理，为49.46%。

2.3 刺梨自然发酵后酵素及残留果实中抗氧化物质含量与抗氧化活性相关性分析

抗氧化能力的强弱由不同种类的抗氧化物质所决定，酚类物质是影响多数水果自然酵素抗氧化活性的重要抗氧化物质[2-5]。刺梨酵素抗氧化物质含量与抗氧化活性的相关性见表6。

表6 刺梨酵素抗氧化物质含量与抗氧化活性的相关性Table 6 The correlation between antioxidant substances and antioxidant activity in Rosa roxburghii natural ferment

刺梨总酚与·OH清除率呈极显著正相关（r=0.99，P＜0.01），与·O2－清除率呈显著相关（r=0.75，P＜0.05），表明酚类物质也是影响刺梨酵素抗氧化活性的重要物质。此外，刺梨酵素中还存在另2种关键抗氧化物质：VC和SOD，其中VC与·OH清除率呈极显著正相关（r=1.00，P＜0.01），与·O2－清除率呈显著相关（r=0.71，P＜0.05），而SOD与·OH 及·O2－清除率均呈极显著正相关（r=0.86，P＜0.01；r=0.96，P＜0.01）。类胡萝卜素与类黄酮在刺梨酵素中与·OH及·O2－清除率均呈极显著负相关，这可能与本试验设置的果糖比质量比有关（表6）。类黄酮在水果酵素中的抗氧化能力不突出，这在冬枣酵素中也得到证实[7]。刺梨酵素中的DPPH·清除率始终维持在较高水平（96%左右），不与果糖质量比及其中的各类抗氧化物质显现相关性。刺梨自然发酵后残留果实中抗氧化物质含量与抗氧化活性的相关性见表7。

表7 刺梨自然发酵后残留果实中抗氧化物质含量与抗氧化活性的相关性Table 7 The correlation between antioxidant substances and antioxidant activity in fruits after Rosa roxburghii natural fermentation

类胡萝卜素、类黄酮和总酚均与·OH及DPPH·清除率均呈显著到极显著正相关，因此这3类物质均是其重要的抗氧化物质。且·OH及DPPH·清除率均与果糖比呈极显著正相关，而·O2－清除率却不与果糖比及类胡萝卜素、类黄酮和总酚显现相关性。

3 结论

刺梨果实与冰糖按 3种质量比（1 ∶1，2∶1，4∶1）均能制作刺梨酵素。果糖质量比1∶1制作的刺梨酵素中 VC、总酚、SOD 酶活性、·OH 清除率与·O2－清除率最高。果糖质量比4∶1自然发酵后残余果实中类胡萝卜素、类黄酮、总酚、·OH清除率与DPPH·清除率最高。刺梨酵素中VC、总酚和SOD酶是主要抗氧化物质，而刺梨自然发酵后残余果实中重要抗氧化物质则是类胡萝卜素、类黄酮和总酚。

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Analysis in Content of Antioxidant Substances and Antioxidant Activity after Natural Fermentation of Rosa roxburghii Fruits

XIONG Qiao-yi，LIU Ding-qun，LUmin
（Guizhou University，Guiyang 550025，Guizhou，China）

Natural ferment of Rosa roxburghii was manufactured at three proportions（mass ratio，1 ∶1，2 ∶1，4 ∶1）between fruits and rock candy.The content of Vitamin C （VC），total phenol，flavonoid，carotenoid and superoxide dismutase（SOD）activity were determined in natural ferment and in fruits after Rosa roxburghii natural fermentation.The superoxide anion radical （·O2－），hydroxyl radical（·OH）and 1，1-，two phenyl，-2-hydrazine group free radical（DPPH·）systems were used to analyze antioxidant activity in vitro.And the correlation between the antioxidant substances and antioxidant activity was compared.The result showed that VC，total phe nol，SOD activity，·OH clearance and·O2－clearance were highest in natural ferment at a proper proportion（1 ∶1）between fruits and rock candy，reached to 1 519.31mg/100mL，60.65mg/mL，8 571.43 U/mL，78.69%and 98.66%respectively，in which VC，total phenol and SOD activity were significantly to very significantly positively correlated to·OH clearance and·O2－clearance.In addition，the total phenol，flavonoid，carotenoid，·OH clearance and DPPH·clearance were at tiptop in fruits after Rosa roxburghii natural fermentation at another proportion （4 ∶1）between fruits and rock candy.The values were severally 32.05mg/100 g，13.55mg/g，37.58mg/g，62.42%and 95.33%.And the total phenol，flavonoid and carotenoid were significantly to very significantly positively correlated to·OH clearance and DPPH·clearance.Whether in natural ferment or in fruits after Rosa roxburghii natural fermentation，very significantly positive correlation was always observed between total phenol and·OH clearance.

Rosa roxburghii；ferment；antioxidant substances；antioxidant activity

熊巧仪，刘丁群，鲁敏.刺梨自然发酵后抗氧化物质含量与抗氧化活性分析[J].食品研究与开发，2018，39（1）：147-151

XIONGQiaoyi，LIUDingqun，LUMin.Analysis inContent ofAntioxidant Substances andAntioxidant Activity after Natural Fermentation of Rosa roxburghii Fruits[J].Food Research and Development，2018，39（1）：147-151

10.3969/j.issn.1005-6521.2018.01.029

国家自然科学基金（31660558）；大学生创新创业计划训练项目（贵大国创字2016018）

熊巧仪（1995—），女（汉），在读本科生，园艺专业。

*通信作者：鲁敏（1984—），女（汉），副教授，博士，研究方向：果树生理与分子生物学。

2017-06-08