HPLC分析测定不同茶叶中的游离氨基酸

（扬州工业职业技术学院，江苏扬州225127）

HPLC分析测定不同茶叶中的游离氨基酸

王富花

（扬州工业职业技术学院，江苏扬州225127）

分析检测不同茶叶（绿茶，红茶，乌龙茶）中游离氨基酸的组成。称取0.25 g的茶叶于10mL 90℃纯净水中浸提20min后过0.45 μm纤维素膜，滤液通过固相萃取（solid phase extraction cartridges，SPE）柱预处理后得到茶汤样品。取70 μL的样品与10 μL的邻苯二甲醛（OPA）衍生液在25℃水浴中反应2min后通过高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）测定，色谱条件为C18柱，DAD检测器，338 nm检测波长，流动相A为甲醇-乙腈-水溶液，流动相B为磷酸盐缓冲液。试验表明：通过SPE柱能有效去除影响色谱出峰的杂质，HPLC方法能有效地分离测定茶叶中的17种不同氨基酸，绿茶中的氨基酸含量要比发酵茶高，尤其是天冬氨酸、谷氨酸，而茶氨酸在3种茶叶中的含量显著不同。

氨基酸；高效液相色谱法；固相萃取；茶叶

茶圣陆羽《茶经》中精论：“茶之为用，味之寒，为饮为最，精行俭德之人，若热渴、凝闷、脑疼、目涩、四肢烦、百节不舒，聊四五啜，与醍醐甘露抗衡也。”茶叶根据加工方法不同，有红茶、绿茶、青茶（乌龙茶）、白茶、黄茶和黑茶六大基本茶类[1]。红茶在世界范围内畅销，而绿茶和乌龙茶的消费地区主要是在亚洲和北非[2]。茶叶中主要含有茶多酚、生物碱、茶多糖、茶色素、维生素、氨基酸、矿物质元素等[3]。其中氨基酸有20多种，它们是茶叶主要的鲜爽滋味成分，对茶叶的香气形成以及汤色起重要作用。

氨基酸是茶叶中具有氨基和羧基的有机化合物，是茶叶中的主要化学成分之一。茶叶中的氨基酸，不仅是组成蛋白质的基本单位，也是活性肽、酶和其他一些生物活性分子的重要组成成分。茶叶氨基酸的组成、含量以及它们的降解产物和转化产物也直接影响茶叶品质[4]。氨基酸在茶叶加工中参与茶叶香气的形成，它所转化而成的挥发性醛或其他产物，都是茶叶香气的成分[5]。此外，有些氨基酸本身也具有一定的香味，特别是某些氨基酸与茶叶的滋味及香气关系密切，是构成绿茶品质的极重要的成分之一。由于茶叶中氨基酸对茶叶品质有重要作用，多年来备受重视。

中性氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、半氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸等。其中甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸为必需氨基酸，在茶叶滋味的协调中具有重要作用。酸性氨基酸主要包括谷氨酸和天冬氨酸，它们是茶叶中最重要的一类氨基酸，在茶叶中的含量高，是构成茶叶鲜爽滋味的重要成分[6]。碱性氨基酸茶叶中主要有精氨酸和赖氨酸。

茶氨酸是茶叶中的特征游离氨基酸，它具有鲜爽滋味，对茶叶的香气形成以及汤色起重要作用[7]。近年来茶叶中茶氨酸的研究内容包括茶氨酸在各种茶叶中的分布；茶氨酸的体内代谢机制及其生理功能；茶氨酸的提取、检测方法（氨基酸分析仪法、高效液相色谱法、毛细管电泳法等）；以及茶氨酸在食品领域的应用等。大量研究表明，茶叶中的氨基酸具有促进大脑功能和神经的生长、降压安神、抗肿瘤等生理功能。

本实验采用高效液相色谱法，结合SPE柱对茶汤的预处理，对茶叶中游离氨基酸的检验测定，有利于进一步地进行茶叶中氨基酸的定量分析。

1 材料与方法

1.1 试验器材

RE-5286A型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；HH-2型电热数显恒温水浴锅：常州金坛市科兴仪器厂；Sep-Pak Cartridges固相微萃取柱（SPE）：美国 Waters公司；AgilentZORBAXEclipseXDB-C18柱（4.6mm×15 mm×5 μm）：美国 Agilent公司。

1.2 试验试剂

乙醇：上海中试化工总公司；甲醇：江苏汉邦科技有限公司；磷酸氢二钠：上海凌峰化学试剂有限公司；邻苯二甲醛：国药集团化学试剂有限公司。

1.3 样品与标准品

1.3.1 茶样

绿茶（信阳毛尖，河南信阳）；乌龙茶（冻顶乌龙，台湾）；红茶（祁门红茶，安徽）。

1.3.2 标准氨基酸样品

L-苏氨酸（L-Thr），L-赖氨酸（L-Lys），L-苯丙氨酸（L-Phe），L-精氨酸（L-Arg），L-甲硫氨酸（L-Met），L-组氨酸（L-His），L-甘氨酸（L-Gly），L-天冬酰胺（LAsn），L-丝氨酸（L-Ser），L-亮氨酸（L-Leu），L-异亮氨酸（L-Ile），L-丙氨酸（L-Ala），L-天冬氨酸（L-Asp），L-色氨酸（L-Trp），L-酪氨酸（L-Tyr），纯度均≥99.0%：西宝生物科技（上海）股份有限公司；茶氨酸（L-Thea）：上海抚生实业有限公司；谷氨酸（L-Glu）：上海宸功生物技术有限公司。

1.4 方法

1.4.1 试剂的配制

1）甲醇-乙腈-水流动相：体积比 45∶45∶10 混合。

2）40 mmol/L磷酸盐缓冲液：用盐酸调节pH至7.5～7.6。

3）OPA衍生剂：取5mgOPA试剂，依次加入0.05mL甲醇、0.45mL 硼酸钠溶液（0.4 mol/L）、0.025mL β-巯基乙醇，混合均匀。

1.4.2 标准氨基酸样液的制备

1）标准氨基酸纯样液的制备：取标准氨基酸样品1mg溶于1mL纯净水，得1mg/mL标准溶液。

2）标准氨基酸混样液的制备：将17种标准氨基酸的纯样液按照一定比例混合制备而成。

1.4.3 茶样的制备

1）初始茶样的制备：取祁门红茶0.25 g浸入10mL沸水中，于90℃恒温水浴20min，取出后过滤，滤液过0.45 μm纤维素膜得到初始茶样。

2）SPE柱的活化：先用30mL的甲醇通过SPE柱（速度控制在1mL/min左右），再用10mL水将甲醇洗净。

3）初始茶样的SPE柱处理：取制备的初始茶样过SPE柱，接取1mL后用5 mL10%乙醇溶液再次洗脱，将两次的洗脱液合并后，将合并的溶液置于旋转蒸发仪中旋转蒸干，用1mL纯净水复溶，复溶液过0.45 μm纤维素膜得到用于HPLC检测的茶样品溶液。

1.4.4 氨基酸的柱前衍生化反应

取样液70 μL与OPA衍生液10 μL于25℃恒温水浴中准确反应2min。

1.4.5 氨基酸的检测方法

1）仪器条件：采用ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱；DAD检测器，338 nm紫外检测波长；进样量为20 μL；柱温为40℃；流动相A为甲醇-乙腈-水溶液，流动相B为40 mmol/L磷酸盐缓冲液，pH7.5；流速为1mL/min。

2）洗脱梯度如表1。

表1 HPLC流动相的洗脱梯度Table 1 The elution gradient of the mobile phase of HPLC

1.4.6 标准氨基酸的HPLC检测方法

1.4.6.1 标准氨基酸纯样液的HPLC检测

取标准氨基酸样品，OPA衍生化后，进行HPLC测定。

1.4.6.2 标准氨基酸混样液的HPLC检测

取标准氨基酸混合样品进行试验，方法如1.4.6.1。

1.4.6.3 标准曲线的绘制

分别取17种标准氨基酸样品（1mg/mL）配制成以 下 反 应 浓 度 梯 度 ：0.05、0.025、0.005、0.002 5、0.001 25mg/mL，衍生化后按照上面的色谱条件进行HPLC检测，绘制标准曲线，计算回归方程。

1.4.7 茶叶样品的HPLC检测方法

使用不同浓度，不同量的乙醇洗脱液SPE处理的绿茶的HPLC检测、经过SPE柱处理的祁门红茶的HPLC检测以及未经过SPE处理的乌龙茶的HPLC检测均参考文献[8-9]报道的方法。

1.4.8 检测限（LOD），定量限（LOQ），回收率值的测定

d：标准曲线y轴截距的标准偏差

s：标准曲线斜率的平均值。

称取一定量的标准氨基酸样品在衍生化反应后通过HPLC法测定其含量，测定值与真实值的比值为HPLC方法的回收率测定值。同理，测定SPE柱方法的回收率。计算LOD及LOQ值，标准曲线的制作需要平行测定3次。

2 结果与分析

2.1 HPLC方法的确立

17种标准氨基酸混合样品经HPLC检测的色谱图如图1所示。

图1 17种标准氨基酸混样经HPLC检测的色谱图Fig.1 Chromatogram of 17 standard amino acid mixed samples by HPLC

色谱图中，任意相邻两个色谱峰的分离度都大于1.8，而分离度等于1.5为相邻两峰完全分开的标志[7]。由色谱图测定17种氨基酸的保留时间如表2。

2.2 不同品种茶样的色谱图

未经过SPE柱处理和经过SPE柱预处理的绿茶色谱图如图2所示。

图3表示的是经SPE柱预处理的红茶的色谱图。

图4表示的是未经SPE柱预处理的乌龙茶的色谱图。

上述色谱图可以进行茶叶（信阳毛尖、冻顶乌龙、祁门红茶）中游离氨基酸组分的定性分析。从图2中可以发现茶样通过SPE柱处理后可以有效地除去杂质峰，这些杂质的保留时间在14min～19min内，并且在3种SPE预处理的方法中，使用5 mL10%的乙醇效果最好，能够将被SPE柱内固定相吸附的氨基酸洗脱下来，从而减少试验误差。图3、图4比较发现茶鲜叶经过不同程度的发酵制成乌龙茶、红茶后，氨基酸的种类基本没有变化。

表2 17种氨基酸的出峰顺序及保留时间Table 2 17 peaks of amino acids and retention time

续表2 17种氨基酸的出峰顺序及保留时间Continue table 2 17 peaks of amino acids and retention time

2.3 茶叶中游离氨基酸的定量分析

信阳毛尖，祁门红茶，冻顶乌龙茶中游离氨基酸的含量如表3所示。

图2 不同预处理的绿茶色谱图Fig.2 Different pretreatment of green tea chromatograms

图3 SPE柱预处理的红茶的色谱图Fig.3 SPE column pretreatment of black tea

氨基酸是构成茶汤鲜爽滋味的主体成分，某些氨基酸如谷氨酸、苯丙氨酸也具有一定的芳香。众多的研究结果均表明，绿茶中的氨基酸含量与品质呈显著的正相关，氨基酸含量高，绿茶品质好[7]。

图4 未经SPE柱预处理的乌龙茶的色谱图Fig.4 Chromatogram of oolong tea pretreated without SPE column

表3 信阳毛尖，祁门红茶，冻顶乌龙茶中游离氨基酸的含量Table 3 The content of free amino acids in Xinyang Maojian，Qimen black tea and frozen top oolong tea

有资料表明，信阳毛尖的氨基酸含量以茶氨酸最高，占总量的70%以上，其次是谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸[10]。试验结果则表明，不管何种茶叶，茶氨酸的含量占绝对的优势。信阳毛尖中，天冬氨酸、天冬酰胺、组氨酸，精氨酸的含量比较高，丙氨酸未检测出。祁门红茶中氨基酸的含量比较均衡，天冬酰胺、组氨酸的含量较高，而甘氨酸未检测出。冻顶乌龙茶中天冬酰胺和天冬氨酸的含量较高，甘氨酸未检出。乌龙茶为半发酵茶，但除天冬氨酸外，其余种类的氨基酸含量均比祁门红茶中的氨基酸含量低。

氨基酸在红茶制造中的变化比较复杂。在红茶制造的萎凋阶段明显增加，以后各工序又逐渐减少。在红茶制造的萎凋、揉捻和发酵阶段，由于酶或邻醌的作用，可使氨基酸氧化成醇、醛类香气。氨基酸除本身偶联氧化形成红茶香气物质醇、醛外，还是红茶加工中许多芳香物质形成的先质[11]。

茶鲜叶经过发酵制成红茶，氨基酸在种类上来说是基本没有变化的，但是从各种氨基酸的数量来说，乌龙茶和红茶都比鲜叶低，说明发酵过程中氨基酸的降解作用是显著的[12]。

2.4 LOD、LOQ、回收率值

LOD、LOQ、回收率值的测定结果如表4所示。

表4LOD、LOQ、回收率测定值Table 4 LOD，LOQ and recovery rate

LOD 值为 3.4ng～28.6ng，LOQ 值为 11.8ng～94.6ng。HPLC方法的回收率值中，Thr的得率是最低的，为89.8%，其余的各种氨基酸的回收率都在90%以上，说明HPLC的测定方法较好。试验过程中，如果将茶汤直接通过SPE柱后，会有部分氨基酸被SPE柱的固定相吸附，导致氨基酸未被检出。改进试验方法后，茶汤通过SPE柱后，再用5 mL10%的乙醇溶液再次洗脱，将两次洗脱液合并后检测，能够正常检测出应有的氨基酸成份，并且SPE柱方法的回收率在89.3%～112.5%，说明该方法是有效的。

3 结论

本试验主要研究了HPLC法分析绿茶、红茶和乌龙茶中的游离氨基酸的组成，使用了SPE柱进行茶汤样品的预处理，扩大了SPE柱的使用范围，并且效果较好。SPE柱和HPLC方法的回收率测定值均在89%以上，能够一次性检测出茶叶样品中的17种氨基酸。氨基酸的种类在3种茶叶中差别不大，但数量差异明显，绿茶中的氨基酸含量比发酵茶要多，尤其是绿茶中的酸性氨基酸和碱性氨基酸的含量较高，说明发酵过程中这两类氨基酸的降解作用是明显的。而祁门红茶中的氨基酸除了天冬氨酸和谷氨酸外，其余的氨基酸含量都要比乌龙茶多。

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Analysis and Determination of Free Amino Acids in Different Tea by HPLC

WANG Fu-hua
（Yangzhou Polytechnology Institute，Yangzhou 225127，Jiangsu，China）

The composition of free amino acids in different tea （green tea，black tea and oolong tea）is analyzed.Each dried pretreated tea（0.25 g）was extracted by 10mL pure water in a designed temperature（90 ℃），extraction time 20min.then filtrated through 0.45 μm cellulose membrane，pretreated by SPE column.Take 70 μL samples and 10 μL O-phthalaldehyde（OPA）derivatization liquid in water bath reaction at a temperature of 25℃，2 minutes later were determined by high performance liquid chromatography（HPLC），chromatographic condition was performed on a C18column，DAD detector，detection wavelength was 338 nm.The mobile phase A was the methanol acetonitrile water solution，and the mobile phase B was the phosphate buffer solution.The results showed that the solid phase extraction cartridges（SPE）column treatment could effectively remove the influence of chromatographic peaks of impurities，and the HPLC method could be effective for the separation and determination of 17 kinds of amino acids in different tea，the content of amino acid in green tea was higher than fermented tea，especially aspartic acid，glutamic acid，and the content of L-Theanine in three kinds of tea was significantly different.

amino acid；HPLC；SPE；tea

王富花.HPLC分析测定不同茶叶中的游离氨基酸[J].食品研究与开发，2018，39（1）：141-146

WANGFuhua.AnalysisandDeterminationofFreeAminoAcidsinDifferentTeabyHPLC[J].FoodResearchand Development，2018，39（1）：141-146

10.3969/j.issn.1005-6521.2018.01.028

王富花（1976—），女（苗），副教授，硕士，研究方向：天然产物提取分离纯化。

2017-05-25