核桃褐斑病病原菌的分离鉴定和发病规律的调查

杨 莉，杨双昱，麻文建，周建华

(四川省林业科学研究院，四川 成都 610081)

核桃褐斑病病原菌的分离鉴定和发病规律的调查

杨 莉，杨双昱，麻文建，周建华*

(四川省林业科学研究院，四川 成都 610081)

目的为了明确四川核桃褐斑病的病原菌及其发病规律。方法采用组织分离法，对四川中江核桃果园自然发病的核桃病原菌进行分离，并回接检测分离物的致病性；结合孢子形态学、ITS序列和gdp序列分析对病原菌进行鉴定；同时对核桃褐斑病的发病规律进行了调查。结果分离得到6种真菌，回接只有菌株ZJ5能使核桃发病；孢子形态和多序列比较分析将菌株ZJ5鉴定为链格孢菌；调查明确了核桃褐斑病的发病规律。结论本文首次报道了四川核桃褐斑病病原菌为链格孢菌，并揭示了该病原菌的发病规律。

核桃；褐斑病；病原菌；发病规律

核桃(JuglansregiaLinn.)是世界四大干果之一，果实营养丰富，含有人体所需的多种微量元素，以及不饱和脂肪酸，被认为是有益于健康的食品，也是我国重要的“木本粮油”战略树种[1]。四川省是我国核桃生产大省，资源极其丰富，产量居全国第二。近年来四川核产业发展迅猛，全省核桃栽培面积和产量由20世纪50年代的4 600多hm2及年产606 t发展到2000年的6.5万hm2及年产29 834.39 t[2]，到2016年底核桃种植面积已达1 300万 hm2，而其病害发生也呈现爆发趋势。核桃褐斑病的侵染造成核桃果实黑果、烂果、提前掉果，对核桃产业造成巨大的经济损失，该病害是目前四川地区阻碍核桃产业发展的最重要问题。为此，本文就核桃褐斑病的病原进行分离鉴定，对该病害的发生规律进行了调查，为该病害的防治奠定基础。

1 材料与方法

1.1 病原菌的分离纯化

样品采集:供试植物样品采自四川省中江县双龙镇核桃园自然发病的核桃果实。

PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂18 g，自来水1 000 mL。

病原的分离：采用组织分离法[3],将采回的病果用自来水清洗表面，吸水纸擦干。用无菌手术刀在病健交界处取0.5 cm×0.5 cm的组织块，浸泡于70%酒精中，表面消毒30 s，组织块转入5%次氯酸钠溶液消毒1 min，无菌水冲洗3次，用无菌吸水纸吸干残留水分，再将组织块置于PDA平板上，28℃、12 h/12 h光照-黑暗交替培养7 d。

病原的纯化：分离得到的真菌，用无菌水将菌孢子洗脱、稀释到平均每视野只有一个孢子，在显微镜下直接将孢子挑取到PDA平板上，28℃、12 h/12 h光照-黑暗交替培养7 d、备用。

1.2 真菌致病性检测

根据柯赫氏法则，将分离纯化得到的真菌回接到健康的核桃果实上。核桃果实表面用酒精、无菌水清洗后晾干，用无菌打孔器把纯化好的真菌打成菌饼，核桃绿皮上打孔，用无菌镊子将真菌菌饼转入核桃果皮圆孔内，用保鲜膜封闭接种孔，将核桃置于28℃人工气候箱保湿培养3 d，观察记录发病情况。每种真菌接种三个核桃，用空白PDA培养基接种做对照。田间接种方法同室内接种方法相同。接种后发病的果实再用组织分离法进行分离培养病原菌。

1.3 病原菌孢子显微形态的观察

将接种发病后再分离得到的病原菌，用PDA培养基28℃、14 d遮光培养，得到的菌孢子用于显微观察。

1.4 病原真菌的初步鉴定

本研究选择了ITS 和gdp (3-磷酸甘油醛脱氢酶)基因序列对分离到的致病菌株进行扩增，所需引物见表1，PCR产物克隆到pMD18后送样测序。测序结果通过Blast比对，根据比对结果选取与研究菌株序列接近的种的代表菌株序列，用软件Clustal X1.81与研究菌株的序列进行比对，用PAUP* 4.0 Bata10制作系统进化树。

表1 引物

1.5 发病规律的调查

根据四川省核桃病害发生特点，在2014年2月—2015年2月，对德阳市中江县双龙镇核桃果园核桃褐斑病进行病害调查。调查随机选择5年生以上盛果期核桃树，在果园内随机选取5个样地，每个样地大小为20 m×20 m，每样地随机选择10棵核桃树，每株树随机选取30个果实进行调查。在果园树枝上悬挂野外温度湿度记录仪，记录每次采样的温度和湿度。

2 实验结果

2.1 核桃褐斑病症状

核桃褐斑病主要发生于果实，也危害叶片。发病初期，果实出现大小不均匀，形状不规则的多个小黑点，随着病程的推移，小黑点逐渐变大连成一片，形成较大黑斑，到发病后期，果实上的黑斑更大、凹陷，黑斑中部潮湿，大多有黑水流出，并且在黑斑上可见白色菌丝，果实提前掉落。叶片感病后，出现不规则黑色病斑，后期病斑变大，叶片掉落。该病在四川一般6月中下旬开始发病，随着气温的升高和降雨的增多到8月中旬开始大量落果，造成巨大损失。

2.2 病原菌的获得

采自四川中江双龙镇核桃果园自然发病的核桃样品，通过组织分离，从形态上判断，初步得到了6种真菌，根据菌落形态统计，类似菌株ZJ5的分离率可达70%。将6种真菌纯化后，回接到核桃上，菌株ZJ5回接后表现的症状与自然发病表现的典型症状相同，在田间和室内接种均能让核桃产生典型症状，如图1，再次通过组织分离法，从发病的核桃果实上分离得到了该病原菌。而其他5种真菌接种后无明显症状发生，表现和空白对照一致。

2.3 病原菌的初步鉴定

菌株ZJ5在PDA培养基上28℃，光照/黑暗(12 h/12 h)交替培养4 d后，可见白色菌落，继续培养3 d，菌落由白色转为灰色，菌落背面为褐色，继续培养，最后变成深灰色，背面深褐色。该菌在PDA上培养，菌落圆形，菌丝疏松，气生菌丝旺盛。

a.实验室接种实验；b.田间接种实验；c.接种无菌PDA的对照。a. The walnut fruit inoculated with wild strain ZJ5 in laboratory experiment； b. The walnut fruit inoculated with wild strain ZJ5 in field experiment；c. The walnut fruit inoculated with a sterile PDA.图1 核桃褐斑病病原菌致病性检测Fig. 1 Pathogenicity assay on walnut fruit of the walnut brown spot disease pathogen

图2 核桃褐斑病病原菌孢子的显微形态Fig.2 Micro-morphology of the pathogenic spore of walnut brown spot disease

泳道1：Marker；泳道2：gdp基因扩增产物，大小为460 bp；泳道3：ITS序列扩增产物，大小为550 bp。lane 1, Marker; lane 2, gdp sequences of wild strain ZJ5, 460 bp; lane 3, ITS sequences of wild strain ZJ5, 550 bp.图3 PCR扩增菌株ZJ5 ITS序列和gdp序列电泳图Fig.3 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification of ITS sequences and gdp sequences of wild strain ZJ5

图4 菌株ZJ5 ITS序列和gdp序列联合系统进化分析Fig.4 Neighbour-joining phylogenetic tree based on ITS sequences and partial gdp gene sequence of strain ZJ5

通过PCR扩增得到了ZJ5菌株的ITS序列和gdp基因序列(图3)，联合两个基因进行系统进化树分析发现该病原与链格孢属的链格孢菌处于同一分支，ZJ5鉴定为A.alternata。(图4)。

2.4 病原菌的侵染循环

2014年2月中旬在该果园采集干枯病叶病果，实验室显微观察发现链格孢以分生孢子在枯死病叶病果上越冬(图5)。3月初，从野外温度记录仪读取的温度显示，当日间气温达到16℃时采回的枯枝落叶上可见孢子开始萌发侵染核桃叶片(图6)，由此可见链格孢分生孢子是核桃褐斑病初侵染来源。直到6月中旬核桃果实可见黑色小病斑，实验室分离能得到链格孢菌落，但此时病果病叶上极少见到链格孢菌的分生孢子。7月下旬8月初感病严重的核桃病叶病果开始掉落干枯，可在干枯掉落的病叶上检查到链格孢的分生孢子(图7)，即为再侵染来源。此后链格孢分生孢子不断反复侵染核桃叶片和果实，直到秋季掉叶为止，病原又以分生孢子在干枯的病果病叶上越冬，准备来年的侵染。

图5 病叶上越冬的链格孢Fig.5 The overwintering spores of Alternaria alternata on diseased leaves

图6 开始萌发的链格孢Fig.6 Germinating spores of Alternaria alternate

图7 链格孢再侵染来源Fig.7 The secondary source of infection Alternaria alternate

3 讨论

核桃褐斑病，又称褐色顶端坏死病，现已成为四川地区阻止核桃产业发展的瓶颈问题，但到目前为止该病害真正的病原菌还存在争议。1999年Belisario 等首次报道了意大利和法国核桃果园中的褐色顶端坏死病[6]，但是并没有确定引起该病害的病原，只是从该病害中分离到了镰刀菌属(Fusariumsp.)、链格孢菌属(Alternariasp.)、枝孢菌属(Cladosporiumsp.)、拟茎点霉属(Phomopsissp.)、炭疽菌属(Colletotrichumsp.)的真菌各1种和核桃黄单胞菌(Xanthomonasarboricolapv.Juglandis)。Belisario等认为[7]，该病害是由几种病菌复合侵染造成的，并且镰刀菌属(Fusariumsp.)真菌可能是引起该病害最主要的病原，但其他真菌与该病害的关系尚不清楚，核桃黄单胞菌(X.arboricolapv.Juglandis)则是引起细菌性黑斑病的病原，与褐色顶端坏死无关。又经过近十年的研究，Belisario发现，该病害是由镰刀菌(Fusariumsp.)和链格孢菌(Alternariasp.)复合侵染造成的[8]，但是Moragrega等则认为[9-10]，核桃黄单胞菌(X.arboricolapv.Juglandis)才是核桃褐色顶端灰色病的主要病原，镰刀菌(Fusariumsp.)可能与细菌共同作用引起核桃顶端坏死病，链格孢菌(Alternariasp.)则有可能是在细菌侵染造成组织坏死后产生的。在国内，2011年曲文文对山东核桃病果进行分离鉴定，得到了链格孢(Alternariaspp.)、成团泛菌(Pantoeaagglomerans)和核桃黄单胞菌(X.arboricolapv.juglandis)，她认为核桃褐色顶端坏死病和黑斑病(Walnut blight)是复合侵染的两种病害，在同一果实上都能分离得到这3种病原菌[11-12]。而朱英芝等[13]报道核桃日规壳(Gnomonialeptostyla)是引起核桃褐斑病叶部病害的病原菌，卢宏林[14]等则认为核桃褐斑病是由核桃盘二孢菌(Marssoninajuglandis(Lib.)Magn.)引起的。Scotton等[15]的最新研究证明了核桃褐斑病是镰刀菌(Fusariumspp.)、链格孢菌(Alternariaspp.)与环境相互作用的结果，是与温度，湿度，种植坡向等环境因素相关，而并不是单个的镰刀菌(Fusariumsp.)或者链格孢菌(Alternariaspp.)侵染发生。本研究从核桃自然发病果实中分离到的能致病的菌株ZJ5被鉴定为链格孢属链格孢菌(A.alternate)，但并未从发病果实中分离得到镰刀菌(Fusariumsp.)、核桃黄单胞(X.arboricolapv.juglandis)、成团泛菌(P.agglomerans)、日规壳(G.leptostyla)、核桃盘二孢(M.juglandis(Lib.)Magn.)等其他可能的致病菌，并且将ZJ5菌株单独接种核桃果实即可致病，由于本研究完成了柯赫氏法则，所以可以判断ZJ5是核桃褐斑病的病原菌。本研究也是首次分离鉴定了四川地区核桃褐斑病的病原菌为链格孢菌(A.alternate)。

另外，本研究对该病害进行了发病规律的调查，该病害一年至少发生两次侵染循环，这与曲文文报道的发病规律是一致的。这对核桃褐斑病的防治打下了基础。

4 结论

本研究分离并鉴定了四川地区核桃褐斑病的病原菌为链格孢菌(A.alternate)。对核桃褐斑病的发病规律进行了调查，明确了四川地区核桃褐斑病一年两次的侵染循环规律。

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IdentificationofPathogenofWalnutBrownSpotandInvestigationoftheDiseaseOccurrence

YANGLi,YANGShuang-yu,MAWen-jian,ZHOUJian-hua

(Sichuan Academy of Forestry, Chengdu 610081, Sichuan, China)

ObjectiveThe purpose of this study is to identify the pathogen of walnut brown spot disease and reveal its pathogenesis in Sichuan.MethodTo isolate the pathogenic bacteria through tissue separation in diseased walnut from walnut orchard in Zhongjiang of Sichuan Province, and its pathogenicity was tested by inoculation back to walnut. The isolated strain was identified by the combination of spore morphology and the multiple sequence analysis of ITS and gdp sequence. And the pathogenesis regularity of walnut brown spot disease was investigated.Result6 fungi were isolated, and just the strain ZJ5 could cause walnut brown spot disease. The strain ZJ5 was identified asAlternariaalternataaccording to the spore morphology and multiple sequence analysis. Beside, the pathogenesis regularity of walnut brown spot disease was revealed by investigation.ConclusionThis is the first report thatA.alternatais the pathogen of walnut brown spot disease in Sichuan and its pathogenesis regularity was studied.

walnut; brown spot disease; pathogen; pathogenesis regularity

10.13275/j.cnki.lykxyj.2017.06.017

2017-02-06

川中核桃褐斑病生物学特性及防治研究(ZL2014-15)

杨 莉(1982—)，女，博士研究生，主要研究植物病原微生物和生物防治细菌。E-mail：51943884@qq.com。

* 通讯作者.

S664.1

A

1001-1498(2017)06-1004-05

崔 贝)