CHO细胞培养生产抗体产量的稳定性

张 进, 王星懿, 范 里, 谭文松

(华东理工大学生物工程学院,生物反应器工程国家重点实验室,上海 200237)

CHO细胞培养生产抗体产量的稳定性

张 进, 王星懿, 范 里, 谭文松

(华东理工大学生物工程学院,生物反应器工程国家重点实验室,上海 200237)

实现了中国仓鼠卵巢(CHO)细胞高密度培养过程的稳定。以表达IgG抗体的流加培养过程为研究对象,首先通过“鱼骨图”分析、FMEA风险评估剖析潜在的关键控制参数,其次通过DOE (实验设计)方法确定和优化关键控制参数及其范围。结果表明,在99个培养过程参数中搜寻并确认了8个关键控制参数及其范围。经优化控制后,表达IgG抗体的流加培养过程批次间抗体产量差异从200%下降至10%。基于QbD理论,能快速有效地实现CHO细胞培养生产抗体产量的稳定性,有利于保证抗体药物生产的安全性以及保障企业的经济效益。

细胞培养技术; QbD; FMEA; 设计范围; 过程控制

抗体药物在乙肝、肿瘤、自身免疫病、病毒感染病等疾病的治疗中发挥重要作用,是生物医药的重要组成部分[1-2]。目前动物细胞培养技术是抗体药物生产的主要手段[3],但是细胞培养过程中涉及的参数多达100多种且大部分随时间变动[4-16],如温度、pH、溶解二氧化碳、溶解氧、渗透压、乳酸、氨等不同程度地影响细胞生长、代谢、抗体产量及质量,使得细胞培养过程十分复杂,很难进行控制。细胞培养过程的不稳定,一方面使得不同批次细胞培养的最终抗体产量和质量不一致,影响抗体药物的安全性;另一方面,增加细胞培养过程失效的可能性,产生资源浪费,降低企业生产的经济效益。

为了控制药物生产过程的稳定,在2004年“质量源于设计”(QbD)理念被提出,并普遍应用于小分子药物生产中,但在生物制药中应用较少[17]。QbD理念提倡在药物开发过程中构建产品质量,这一观念促使人们探究原料和过程参数对药物关键质量属性(CQAs)的影响,通过对生产过程进行控制以达到稳定的目的[17]。在QbD理念的实施过程中,“设计空间”是一项重要的工具,它是指输入变量和过程参数多元结合和相互作用,输入变量和过程参数在该设计空间内变动不会对产品质量造成影响[18]。基于QbD理念,Harms等[19]对毕赤酵母发酵产物的设计空间进行研究,结果表明该发酵过程较为稳定,过程中的参数都不显著影响产物质量;Amadeo等[20]对治疗性重组蛋白下游纯化最稳定、最适的工作条件进行了探究;Cook等[21]对单克隆抗体纯化过程的关键参数进行鉴定并探究其设计空间;Abu-Absi等[18]对细胞培养过程中影响抗体质量的关键过程参数的设计空间进行系统地研究。但QbD理念在细胞培养过程稳定性方面的应用不广泛,目前鲜有针对细胞培养过程产物产量稳定性的研究。

本文以表达IgG抗体的流加培养过程为研究对象,为实现不同批次细胞培养过程中抗体产量的稳定,借鉴QbD理念对于药物产品“设计空间”的研究,首先采用“鱼骨图”分析法罗列可能影响抗体产量稳定的因素、失效模型和效应分析(FMEA)方法对上述因素进行风险评估确定其中可能的关键因素,其次通过DOE (实验设计)方法确定关键因素并优化其控制范围,最后通过对关键因素进行控制以实现流加培养过程的抗体产量稳定。

1 材料与方法

1.1 材料

实验所用的细胞株为中国仓鼠卵巢细胞(CHO),由浙江海正药业有限公司提供。该细胞表达的产物为IgG抗体。

细胞传代所用的培养基为商业无血清培养基Mab-Works Medium C,并添加NaHCO3(1.83 g/L),4-羟基哌嗪乙磺酸(HEPES) (3.57 g/L)。基础培养基及流加培养基由实验室自行开发。配制培养基所用的试剂均采购自Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 技术路线图 本文的技术路线如图1所示。

图1 技术路线图Fig.1 Technology route map

1.2.2 “鱼骨图”分析法 “鱼骨图”分析法是一种罗列系统中存在的工艺参数的方法,它将所关注的目标(VOC)标在鱼头外,通过“头脑风暴”形式,从“人、机、料、法、环”等方面分析,以“鱼刺”的形式将系统所涉及的工艺参数罗列在两侧。

1.2.3 FMEA方法 由于细胞培养过程中所涉及的参数众多,若将所有工艺参数进行优化设计将耗费大量人力、物力和财力。采用FMEA方法可以评估工艺参数影响抗体产量稳定性的风险,从而对过程进行前瞻性预测[22],以便我们挑选风险较大的工艺参数进行后续的优化工作。FMEA是基于已有数据、文献报道或者以往经验对该工艺参数的失效模式可能产生的后果进行风险评估,从严重性(S)、发生频率(O)和易检测度(D) 3个方面进行打分[23]。打分人员应由熟悉细胞培养过程的专业人士构成,不少于10人。将三者平均值相乘,计算风险优先系数(RPN)值,RPN值越高表示失败的风险越高,该因素越有可能对过程产生影响,在后续的研究中应优先考虑[23]。

1.2.4 DOE优化设计 在运用FMEA方法确定影响抗体产量稳定性可能因素的优先次序后,采用DOE的方法探究关键参数、非关键参数以及关键参数的控制措施。在本研究中使用的DOE方法包括Plackett-Burman设计和单因素实验设计。

在本研究中,对参数的分类是基于FMEA风险评估和DOE实验结果两方面的考量,如果参数经FMEA分析后RPN值占前10%,并且经过DOE验证显著影响抗体产量,则该参数定义为影响抗体产量稳定的关键参数[23]。

1.2.5 分析方法 CHO细胞计数采用台盼蓝染色法。抗体产量检测采用高效液相色谱法,用积分的形式获得峰面积,并与标准品的峰面积进行对比,求得样品的浓度。

1.2.6 细胞培养过程稳定性定义 细胞过程稳定定义为:采用相同的工艺条件进行至少3个批次的细胞培养,抗体产量质量浓度的最大差异不超过10%。用公式(1)和(2)表示,当Δtiter≤10%时,可认为过程达到稳定。

其中ρmax为抗体产量质量浓度的最大值,ρmin为抗体质量浓度的最小值,单位为g/L。Relative titer是抗体产量质量浓度相对比值,它是细胞培养某一批次的抗体产量质量浓度与所有批次中抗体产量质量浓度最小值的比值,为方便叙述,统称为相对产量。Max (Relative titer)是细胞培养所有批次中抗体产量质量浓度的最大值与最小值的比值。

2 结果与分析

2.1 采用CHO细胞培养生产抗体过程中产量不稳定现象的描述

采用相同的工艺条件,对CHO细胞进行5批流加培养实验,经过14 d的培养,抗体相对产量如图2所示。由图2可知,抗体产量最高和最低分别为C4和 C2批次,两个批次抗体产量差异Δtiter为200%,远大于10%,说明在原有的培养工艺条件下,抗体产量不稳定。

图2 原工艺条件下5个批次细胞培养的抗体产量相对比值Fig.2 Relative antibody titer of five batches cell culture under the condition of original process

2.2 采用“鱼骨图”分析法剖析CHO细胞培养过程

采用“鱼骨图”分析法剖析CHO细胞培养过程可能影响抗体产量稳定性的因素,结果如图3所示。整个细胞培养过程可分为细胞冻存、细胞复苏、细胞扩培以及细胞培养4个步骤,从“人、机、料、法、环”5个方面归纳总结每个步骤的输入参数,经分析得到可能影响抗体产量的因素有99个,在不同批次的细胞培养过程中,这些因素难以控制一致,使得细胞培养过程中难以达到抗体产量稳定性。

2.3 采用FMEA方法分析影响抗体产量稳定性的潜在关键因素

将“鱼骨图”分析出的可能影响抗体产量稳定性的因素转化成调查问卷,进行FMEA风险评估,标准见表1。首先,对调查问卷中的因素从严重性(S)、发生率(O)和检测率(D) 3个方面打分,其中S是该因素对细胞培养过程产生影响的程度,将其分值设置为1～5分,最低分1分表示几乎不对细胞培养过程产生影响,最高分5分表示导致细胞培养过程失败;O是指该因素在细胞培养过程出现的频率,出现次数高的因素相应的分值较高;D是指在细胞培养过程中通过控制该因素被检测出来的可能性,被检测出的可能性小相应的分值高。其次,将各因素的S、O、D的分值相乘,计算风险优先系数RPN值。FMEA分析后的部分结果见表2。

图3 CHO细胞培养生产抗体过程鱼骨图Fig.3 Fishbone diagram of CHO cell culture producing antibody process

ScoreS O D 1InfluenceoncellcultureprocesscanbeignoredDonothappenAlmostcertainlytobecheckedout2InfluenceoncellcultureprocessissmallRarelyoccurHighpossibilitytobecheckedout3InfluenceoncellcultureprocessismediumSometimesoccurMediumpossibilitytobecheckedout4InfluenceoncellcultureprocessislargeOftenoccurSmallpossibilitytobecheckedout5LeadtothefailureofcellcultureprocessAlwaysoccurNopossibilitytobecheckedout

表2 CHO细胞培养过程部分FMEA分析表

最后,在对CHO细胞培养过程进行FMEA分析后,选定RPN值最高的前5个因素作为潜在的关键因素,进行下一步的研究。这5个因素分别为种子细胞比生长速率、基础培养基的初始pH值、接种方式、取样体积、N-1代种子细胞的传代培养基是否更换为基础培养基。

2.4 通过DOE方法确定影响抗体产量稳定性的关键因素及控制范围

对选定的5个潜在的关键因素进行Plackett-Burman实验,每个因素设置一个高水平和一个低水平,实验结果如图4所示。图4(a)所示为细胞生长曲线,从图中可知这12组实验细胞生长状况差异较大,大多数实验组细胞在第6 d达到生长的最大密度,最高为12.5×106cells/mL,而最低为6×106cells/mL,相差约1倍。图4(b)所示为抗体相对产量,这12组实验抗体产量最高的为第7组,最低的为第10组,相差12%。

将抗体产量作为响应值,对实验数据进行方差分析,如表3所示。其中AdjSS为调整后的离散差平方和;AdjMS为调整后的平均方差和,是调整后的离散差平方和与自由度的比值;F值是方差分析中的一个指标,是组间和组内的离散差平方和与自由度的比值,F值越大,P值越小,表示结果越可靠。当P<0.05时,说明因素为显著性影响因素。实验表明:种子细胞比生长速率,N-1代种子细胞的传代培养基是否更换为基础培养基,基础培养基的初始pH,取样体积这4个因素是抗体产量的显著性影响因素。结合对CHO细胞培养过程关键参数的定义,这4个因素经FMEA分析 RPN值占前10%,且经过DOE验证显著影响抗体产量,是影响抗体产量稳定性的关键因素。在不同实验批次中,若这些因素发生波动,且波动超出控制范围,将引起抗体产量的不稳定。

采用单因素实验对上述4个因素的控制范围进行探究,在该控制范围内变动,不对最终抗体产量产生影响。以N-1代种子细胞传代时原传代培养基与新鲜基础培养基的体积比为例,实验结果如图5所示。

图4 细胞生长曲线(a)以及抗体相对产量比值(b)Fig.4 Cell growth curve (a) and antibody relative titer (b)

DegreeoffreedomAdjSSAdjMSFPModel50．0160490．00321011．510．005Seedcellspecificgrowthrate10．0050110．00501111．510．005PassagemediumofN-1seedcellswhethertobereplacedbybasalmedium10．0040670．00406714．590．009InitialpHvalueofbasalmedium10．0029370．00293710．540．018Inoculationmethod10．0000950．0000950．340．580Samplevolume10．0039380．00393814．130．009Error60．0016730．000279Total110．017721

图5 在N-1代种子细胞传代时更换不同体积比培养基的条件下细胞生长(a)、产物表达情况(b)的比较Fig.5 Growth (a) and productivity (b) comparison under different replacement ratios of generation medium of N-1 seed cells

从细胞生长可以看出,N-1代细胞传代仍采用原传代培养基,细胞培养可持续12 d,最大细胞密度在第6 d达到,约为9×106cells/mL;N-1代细胞传代时原传代培养基与新鲜基础培养基体积比为1∶1,细胞培养可维持10 d,最大细胞密度在第6 d达到,平均为9.3×106cells/mL;N-1代传代时原传代培养基与新鲜基础培养基的体积比为1∶3时,细胞培养可维持10 d,最大细胞密度在第4 d达到,约为8.7×106cells/mL。虽然最大活细胞密度差异不大,但N-1代细胞传代采用原种子培养基,细胞在第6 d之后,活细胞密度下降较慢。

最终抗体产量在N-1代传代培养基不更换的条件下较高,并且该条件与1∶1更换和1∶3更换的条件相比,抗体产量有显著差异(P<0.05)。结果表明,N-1代种子细胞传代培养基不更换时,有利于抗体产生,若由于工艺条件的设置需要更换N-1代传代培养基时,原传代培养基与加入新鲜基础培养基的比例维持在1∶1～1∶3时,不影响抗体产量。

本文对其他影响抗体产量稳定性的关键因素及其控制范围也进行了探讨,汇总如表4所示。

表4 影响抗体产量稳定性的关键因素及其控制范围

2.5 生产工艺改进及新工艺稳定性验证

对上述影响抗体产量稳定性的关键因素进行控制,验证新工艺是否达到稳定。对关键因素的控制条件为:N-1代种子细胞的传代培养基不更换为接种时的基础培养基,接种时种子细胞密度为1.5×106～1.8×106cells/mL,细胞的比生长速率在0.6～0.7 d-1之间,基础培养基的初始pH在7.0～7.2,采用离心接种的方式,使细胞初始接种密度为0.8×106～1.2×106cells/mL,离心后细胞放置时间小于10 min,取样体积为400 μL。实验共4个批次,每个批次设置3个平行,最终抗体产量相对比值如图6所示。

由图6可知在新工艺条件下进行4个批次的细胞培养,抗体产量最高和最低分别为C2和C3批次,抗体产量的差异Δtiter为10%,基本满足对细胞培养过程稳定性的要求。与原工艺条件相比,抗体产量的差异从200%下降至10%,说明在对CHO细胞培养过程影响抗体产量稳定的关键因素进行控制之后,抗体产量稳定性提高。

图6 新工艺条件下4个批次细胞培养的抗体相对产量Fig.6 Relative antibody titer of four batches cell culture under the condition of new process

3 讨 论

CHO细胞培养生产抗体的过程十分复杂,其中影响抗体产量稳定性的因素众多,利用“鱼骨图”分析能够有效地对过程进行拆分描述,并对其中可能影响抗体产量稳定的因素从“人、机、料、法、环”5个方面进行归纳总结,便于发现影响抗体产量稳定性的根本原因。在以往的研究中,“鱼骨图”常用于质量、生产管理、项目管理等领域问题的分析,作为一种定性分析工具,能够帮助人们对问题产生的原因进行系统地评估[24]。赵静等[25]运用“鱼骨图”对影响我国奶源质量安全的主要因素及存在的问题进行分析,提出了针对原料奶质量控制的建议及对策,具有较高的实际应用价值。Volchek等[26]运用“鱼骨图”方法对低质量的医疗卫生造成较高的资源消耗的原因以及组成部分进行了详细地研究,对于这一问题的解决提供了一定的思路。

FMEA分析是生产过程中一项重要的工具,是对过程中存在的故障模式及其可能产生的影响进行分析,通过采取事前预防的措施,对过程进行改进或控制,目前广泛应用于军事、建筑安装工程、船舶与海洋工程、医疗卫生、软件工程及信息系统开发、核工业与食品安全等领域[27]。在过程定性研究中,常利用FMEA对过程的操作参数进行风险评估,确定参数进行实验验证的优先次序。本研究中,通过“鱼骨图”分析出细胞培养过程影响抗体产量稳定的可能输入参数有99个,如果对这些参数均设计实验进行验证,将消耗大量的人力、物力、财力。通过FMEA风险评估,排除可能性较小的因素,选取RPN值较高的因素进行DOE探究,实现问题的简化。

通过DOE验证得出影响抗体产量稳定的因素,包括N-1代细胞传代的传代培养基是否更换为基础培养基、细胞比生长速率、基础培养基的初始pH、取样体积、基础培养基的存放时间、细胞离心后放置时间、细胞初始接种密度、种子细胞密度等。文献[28]报道在37 ℃时,随着CHO细胞比生长速率的提高,r蛋白的比生产速率逐渐提高,比生长速率对产物表达有较大影响,这与本研究的结果一致;文献[10]报道pH是细胞培养过程中重要的测量及控制参数,对细胞生长代谢及产物表达有重要作用,本研究表明基础培养基的pH对最终抗体表达影响较大;培养基中的谷氨酰胺是细胞生长重要的碳源、氮源及能源物质,可通过能量代谢为细胞生长及产物合成提供30%～65%的能量,维生素等物质是维持细胞正常生理状态的重要物质[29],但它们易分解。基础培养基存放时间较长可能造成上述营养物质的缺失,影响细胞生长及产物表达;Abu-Absi等[18]在研究生产单抗的细胞培养过程的设计空间时,发现初始接种密度是影响抗体产量的关键因素,Padawer等[30]发现初始接种密度高的条件下,抗体产量较高,但是细胞凋亡较快,这些研究表明细胞初始接种密度对抗体产量影响较大;Rodriguez等[31]报道种子细胞密度很小的差异就会引起细胞比生长速率产生较大的变化,种子细胞密度可能影响细胞生长进而影响抗体表达。

目前,鲜有针对CHO细胞培养生产抗体过程产量稳定的报道,而保证细胞培养不同批次间抗体产量的稳定,不仅能够保证实验数据的可靠性与可重复性,而且能够满足抗体生产过程对工艺稳定性的要求,对于保证药品生产的安全性及企业的经济效益具有重要作用。本文基于QbD理念,首先通过“鱼骨图”剖析CHO细胞培养过程,其次通过FMEA对可能影响抗体产量稳定的因素进行风险评估,选取RPN值高的因素作为潜在的关键影响因素,然后采用DOE方法,确定其中的关键影响因素及其控制措施,最终在99个可能影响抗体产量稳定的因素中,筛选并得到了8个关键因素及控制范围,经过优化控制后批次间抗体产量的差异从200%缩小至10%,抗体产量稳定性大大提高。本研究填补了CHO细胞培养在抗体产量稳定方面研究的空白,为过程稳定性的研究提供新的思路,具有较高的应用价值。

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TiterStabilityofAntibodyProducedbyCHOCellCulture

ZHANGJin,WANGXing-yi,FANLi,TANWen-song

(StateKeyLaboratoryofBioreactorEngineering,SchoolofBioengineering,EastChinaUniversityofScienceandTechnology,Shanghai200237,China)

The stability of Chinese hamster ovary (CHO) cells during high density cultivation process was realized.The fed-batch culture process expressing IgG antibody was studied based on QbD theory.Firstly,potential critical control parameters were dissected by using “fishbone diagram” analysis and Failure Mode and Effect Analysis (FMEA).Secondly,key control parameters were determined and their design ranges were optimized by DOE (Design of experiment) method.Results show that eight key control parameters and their scope were searched and confirmed within 99 cell culture process parameters.Through optimization and control,difference of antibody titer between batches of fed-batch culture process decreases from 200% to 10%.Based on QbD theory,it can rapidly and effectively achieve process stability of antibody production by CHO cell culture which is benefit for the safety of antibody drug production and the economic benefits of enterprises.

cell culture technology; QbD; FMEA; design space; process control

1006-3080(2017)06-0806-09

10.14135/j.cnki.1006-3080.2017.06.009

2017-05-04

张 进(1992-),女,河南人,硕士生,主要从事动物细胞培养的研究。E-mail:zhangjinecust@163.com

谭文松,E-mail:wstan@ecust.edu.cn

Q813.1+1

A