酸解52 ℃棕榈硬酯制备1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯的工艺研究

李世磊，惠 菊，初柏君，尚嘉毅，刘孟涛，王翔宇,*

1.中粮营养健康研究院有限公司 (北京 102209)2.营养健康与食品安全北京市重点实验室 (北京 102209)

酸解52℃棕榈硬酯制备1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯的工艺研究

李世磊1,2，惠 菊1,2，初柏君1,2，尚嘉毅1,2，刘孟涛1,2，王翔宇1,2,*

1.中粮营养健康研究院有限公司 (北京 102209)2.营养健康与食品安全北京市重点实验室 (北京 102209)

1，3-二油酸-2 -棕榈酸甘油三酯(OPO)是母乳脂肪中重要的组成部分。目前，针对其合成路线的研究，主要通过两步法来实现。本实验以熔点为52 ℃的棕榈硬酯为酰基受体、食品级油酸为酰基供体，采用Lipozyme RM IM脂肪酶为催化剂，通过一步法制备OPO。通过单因素实验，得到最佳反应条件为: 底物摩尔比1∶10，反应温度56 ℃，酶添加量10%，加水量1%，反应时间4 h。在最佳条件下所制备的OPO产品中，sn-2位棕榈酸占总棕榈酸的含量为57.73%，OPO含量为45.23%，PPP的含量为3.86%。

1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯；52 ℃棕榈硬酯；制备工艺

母乳是婴幼儿成长发育过程中最理想的食物和能量来源，可为婴幼儿提供生长所需的碳水化合物、脂类、蛋白质等营养物质。脂肪是母乳中最重要的组成成分之一，其含量约占母乳质量的4%，却提供了婴幼儿生长所需能量的50%～60%。母乳中的脂肪主要以甘油三酯的形式存在[1-2]，不同于常见的植物油脂，母乳脂肪中，以棕榈酸为主的饱和脂肪酸主要分布在甘油三酯的sn-2位，而油酸、亚油酸等不饱和脂肪酸主要分布在甘油三酯的sn-1,3位[3-4]。研究表明，1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯(OPO)是母乳脂肪中重要的组成部分。同时，OPO这种具有特定脂肪酸分布结构的甘油三酯，能够促进婴幼儿对钙的吸收，避免体内皂钙的形成，显著地降低婴幼儿便秘等症状[5-8]。

此前的研究中，制备OPO的原料可分为两类:与母乳脂肪酸组成接近的动物油脂，如猪油；甘油骨架上存在大量棕榈酰基的植物油脂，如棕榈硬脂[9-11]。然而，上述方法存在一定的局限性。使用猪油作为原料，无法通过HALAL清真认证；同时，动物油脂在提炼、贮存过程中存在诸多困难，导致其无法应用于婴幼儿配方奶粉的生产[12-13]。使用棕榈硬脂合成OPO主要通过两步法来实现：首先，将棕榈硬脂进行随机酯交换处理，得到sn-2位富含棕榈酰基的甘油三酯；随后，与油酸进行酸解反应，从而制备OPO产品。此方法在制备OPO的过程中,需要利用两种生物酶作为催化剂，提高了生产成本，可推广性不强。近期研究发现，一种经棕榈油分提得到、熔点为52 ℃的棕榈硬脂，其甘油骨架上，尤其是sn-2位上，富含棕榈酰基，是制备OPO的理想原料。将其与油酸含量为80 %的脂肪酸混合，经一步酶法酸解酯交换反应即可制备OPO，可以有效节约生产成本，并提高生产效率。

本文以52 ℃棕榈硬脂为酰基受体，食品级油酸为酰基供体，采用Lipozyme RM IM脂肪酶为催化剂，通过酶法催化酸解反应制备OPO。之后，采用薄层色谱、气相色谱等分析方法对产品中总棕榈酸含量、sn-2棕榈酸含量及OPO含量(以C52计)。通过分析产物的总棕榈酸含量、sn-2棕榈酸含量、C52含量、C48含量，并计算sn-2棕榈酸占总棕榈酸的比例，确定出酶法催化酸解反应制备OPO的最优的条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

52 ℃棕榈硬脂：东海粮油工业(张家港)有限公司；油酸，食品级：印尼春金集团；脂肪酶Lipozyme RM IM：诺维信(中国)投资有限公司。

薄层层析硅胶板，购于青岛海洋化工有限公司；乙醚、胆酸钠、氯化钙、无水硫酸钠、氢氧化钾、甲醇、氯化钠、盐酸、乙酸等均为分析纯试剂，购于国药集团化学试剂有限公司；三氟化硼甲醇试剂、三羟甲基氨基甲烷、2,7-二氯荧光素、正己烷(色谱纯)购于上海安谱实验科技股份有限公司；十七碳酸甘油三酯标准品：纯度≥99.9%；1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯标准品：纯度≥99.9%，购于西格玛奥德里奇(上海) 贸易有限公司。

1.2 主要仪器和设备

Agilent7890B型气相色谱仪，配有FID检测器，美国安捷伦科技有限公司；TDL-40B台式电动离心机，上海安亭仪器有限公司；2838型水浴锅，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；IKA HS7 加热磁力搅拌器，艾卡(广州)仪器设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1脂肪酶催化制备OPO

取一定摩尔比的52 ℃棕榈硬脂与油酸，置于恒温水浴中，以450 r/min搅拌至混合均匀，加入Lipozyme RM IM脂肪酶后，待反应结束，离心去除脂肪酶，获得产物。

1.3.2总脂肪酸组成分析

通过薄层色谱法进行甘油三酯的分离。取100 mg待测样品,加入100 μL正己烷稀释，点样后置于层析缸中进行薄层层析。层析液为正己烷∶乙醚∶乙酸 = 80∶20∶1 (v/v/v)。刮取甘油三酯条带，根据GB 5009.168—2016甲酯化方法处理后，用气相色谱分析待测样品的总脂肪酸组成。

气相色谱条件：色谱柱,Agilent HP-88毛细管柱，100.0 m×250 μm×0.25 μm；进样器温度270 ℃，检测器温度280 ℃，载气为氮气，分流比100∶1，进样体积1.0 μL；程序升温,初始温度100 ℃，持续13 min；100 ℃～180 ℃,升温速率10 ℃/min，保持6 min；180 ℃～200 ℃，升温速率1 ℃/min，保持20 min；200 ℃～230 ℃，升温速率4 ℃/min，保持10.5 min。

1.3.3sn-2位脂肪酸组成分析

用乙醚提取出经薄层层析色谱法分离出甘油三酯于离心管中。依次向离心管中加入7 mL Tris-HCl缓冲液(pH =8.0,1 mol/L)、2 mL胆酸钠溶液、1 mL氯化钙溶液以及20 mg猪胰脂酶，在40 ℃水浴下静置9 min，期间每3 min振荡1次。待溶液降至室温后，加入2 mL乙醚充分振荡。经离心，取乙醚层，经无水硫酸钠脱水后，用薄层层析色谱法分离出sn-2单甘酯，层析液为正己烷∶乙醚∶乙酸=50∶50∶1(v/v/v)。根据GB 5009.168—2016甲酯化方法处理后，待测样进行气相色谱检测

1.3.4OPO(以C52记)及PPP(以C48记)含量的分析

根据GB 30604-2015中OPO(以C52记)及PPP(以C48记)含量的分析方法，首先，制备十七碳酸甘油三酯、棕榈酸甘油三酯、1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯混标样品(0.2 mg/mL)。之后，以十七碳酸甘油三酯(0.2 mg/mL)为内标，用气相色谱分析待测样品，根据标准样品与待测样品的峰面积计算OPO(以C52记)及PPP(以C48记)含量。

气相色谱条件：色谱柱，Agilent DB-1HT毛细管柱，15.0 m×250 μm×0.1 μm；进样口温度320 ℃，检测器温度370 ℃，载气为氮气，恒压模式，进样体积1.0 μL；升温程序，300 ℃保持3 min，以20 ℃/min的速率升至380 ℃，保持10 min。

2 结果与讨论

2.1 反应底物脂肪酸分析

ST52的脂肪酸组成分析结果如表1所示。

表1 ST52脂肪酸组成分析

表2 油酸组成分析

从表1可以看出，ST52中sn-2位棕榈酸含量达到了41.70%，这是合成高含量OPO的基础。然而，sn-2位棕榈酸仅占总棕榈酸的22.71%，说明仍有大量棕榈酸分布在sn-1,3位。因此，在制备OPO的过程中，需要降低sn-1,3位的棕榈酸含量。食品级油酸中油酸含量高达78.81%(见表2)，是良好的油酸酰基供体。因此，以ST52与高纯度油酸为反应底物，在sn-1,3专一性脂肪酶的催化作用下，用油酸取代ST52中sn-1,3的棕榈酸，可作为一条简单易行又可节约成本的OPO制备路线。

2.2 底物摩尔比的影响

将ST52与食品级油酸以不同的摩尔比混合，加入占底物总质量10%的脂肪酶 Lipozyme RM IM，在56 ℃下进行酶催化反应，并在反应进行到2 h、3 h、4 h、5 h、6 h时取样检测。气相分析脂肪酸组成结果如图1所示。

图1 底物摩尔比对棕榈酸含量、sn-2棕榈酸含量、C52含量、C48含量的影响

从图1中可以看出，随着反应的进行，产物中总棕榈酸的含量逐渐降低，并在4 h后趋于稳定，且底物中油酸所占比例越大，产物中总棕榈酸的含量越低。这表明，反应过程中油酸取代了ST52中的棕榈酸，且油酸添加量越多，其所取代的棕榈酸也越多。反应中sn-2位棕榈酸的含量随着反应时间延长及底物中油酸占比增加而下降，这说明反应过程中出现了酰基转移。并且，反应时间的延长和油酸所占比例的增加，对酰基转移均有促进作用。通过计算sn-2位棕榈酸占总棕榈酸的百分比发现，随着油酸比例的增加，sn-2位棕榈酸占总棕榈酸的百分比也在增加。但相比于底物比为1∶6和1∶8，底物比为1∶10、1∶12、1∶14时，增长幅度较缓，这说明过量油酸对反应促进作用逐渐减小。分析产物中C52及C48的含量发现，五组反应产物的C52含量均高于40%且C48含量低于10%。综合以上数据分析，并参考反应原料的成本，选择底物摩尔比1∶10为最适底物比。

2.3 反应温度的影响

将ST52与食品级油酸以摩尔比1∶10混合，加入占底物总质量10%的脂肪酶 Lipozyme RM IM，在不同温度下进行酶催化反应，并在反应进行到2 h、3 h、4 h、5 h、6 h时取样检测。气相分析脂肪酸组成结果如图2所示。

图2 反应温度对棕榈酸含量、sn-2棕榈酸含量、C52含量、C48含量的影响

从图2可以看出，随着反应温度的增加，产物中总棕榈酸的含量在不断降低，并在4 h左右趋于平衡。这说明反应温度升高能够提升的酶法酯交换的效率，使得更多的油酸取代了棕榈硬酯分子结构中的棕榈酸。然而，反应温度升高也会导致sn-2棕榈酸含量降低，这说明温度升高将增加酰基转移现象的发生，在60 ℃和64 ℃下，sn-2棕榈酸的含量下降速度明显加快，这说明过高的温度不利于反应的进行。通过计算sn-2棕榈酸占总棕榈酸的百分比发现，在3 h以内，sn-2棕榈酸占总棕榈酸的百分比随着反应温度的增长而增加，而3 h后，反应温度为60 ℃和64 ℃时，sn-2棕榈酸占总棕榈酸的百分比迅速降低。在反应趋于平衡(4 h)时，反应温度为56 ℃，sn-2棕榈酸占总棕榈酸的百分比最高。分析产物中C52及C48的含量发现，五组反应产物的C52含量均高于40%且C48含量低于10%。综合以上数据分析，选择56 ℃为最适反应温度。

2.4 酶添加量的影响

将ST52与食品级油酸以1∶10的摩尔比混合，加入占底物总质量不同比例的脂肪酶Lipozyme RM IM，在56 ℃下进行酶催化反应，并在反应进行到2 h、3 h、4 h、5 h、6 h时取样检测。气相分析脂肪酸组成结果如图3所示。

从图3中可以看出，随着反应的进行，产物中总棕榈酸的含量在不断降低，但各组反应达到平衡状态的时间不同。酶添加量为5%和10%时，酯交换反应在4 h达到平衡，而当酶添加量15%、20%、25%时，反应在3 h时达到平衡。因此，酶添加量增加会提升反应速度，使反应更快的达到平衡状态。

图3 酶添加量对棕榈酸含量、sn-2棕榈酸含量、C52含量、C48含量的影响

然而，酶量的增加意味着体系内进行的反应数量会增加，相应的副反应数量也会更多，酰基转移出现的概率也会增大。当酶添加量为15%、20%、25%时，sn-2位棕榈酸的含量在一定时间后迅速降低。通过计算sn-2位棕榈酸占总棕榈酸的百分比发现，当酶添加量为5%和10%时，sn-2棕榈酸占总棕榈酸的百分比会随着反应的进行而增加，并在4 h后趋于稳定；而当酶添加量为15%、20%、25%时，sn-2棕榈酸占总棕榈酸的百分比在3 h前趋于稳定，而后快速降低，这说明酶添加量的增加促进了酰基转移的发生；当酶添加量为10%，反应4 h时，sn-2棕榈酸占总棕榈酸的百分比达到最大值(57.36%)。分析产物中C52及C48的含量发现，五组反应产物的C52含量均高于40%且C48含量低于10%。综合以上数据分析，选择10%的酶添加量为实验的最适添加量。

2.5 加水量的影响

根据文献报道，在酶催化酯交换反应体系中加入适量的水会提高酶的活性，提高反应效率，但过量水的存在会导致甘油三酯发生水解，降低产物得率[14-17]。为了考察酶催化酯交换体系中的最适加水量，选择实验条件如下：将ST52与食品级油酸以1∶10的摩尔比混合，加入占底物总质量10%的脂肪酶 Lipozyme RM IM，并分别加入占酶重量0%、0.5%、1%、1.5%、2%的水，在56 ℃下进行酶催化反应，并在反应进行到2 h、3 h、4 h、5 h、6 h时取样检测。气相分析脂肪酸组成结果如图4所示。

图4 加水量对棕榈酸含量、sn-2棕榈酸含量、C52含量、C48含量的影响

从图中可以看出产物中总棕榈酸的含量随着反应时间和加水量的增加而降低，并在4 h左右趋于平衡。从图4中可以看出，随着反应时间的延长，产物中sn-2位棕榈酸的含量呈下降趋势，且加水量越多，sn-2位棕榈酸的含量下降越快。这可能是因为加水量的增加将提高甘油三酯水解反应发生的概率。水解反应将生成大量的甘油二酯，从而导致酰基转移发生的概率增大。通过计算sn-2位棕榈酸占总棕榈酸的百分比发现，当加水量为酶量的1%，反应4 h时，sn-2位棕榈酸占总棕榈酸的百分比达到最大值(57.73%)。分析产物中C52及C48的含量发现，五组反应产物的C52含量均高于40%，且C48含量低于10%。综合以上数据分析，选择加量占酶量1%为最适加水量。

3 结论

本文以52 ℃棕榈硬酯为酰基受体、食品级油酸为酰基供体，采用Lipozyme RM IM脂肪酶为催化剂，采用一步酶法催化酸解反应制备OPO。通过单因素实验得到最佳反应条件为：底物摩尔比1∶10，反应温度56 ℃，酶添加量10%，加水量占酶量1%，反应时间为4 h。在最佳条件下所制备的OPO产品中，sn-2位棕榈酸占总棕榈酸的含量为57.73%，OPO含量为45.23%，PPP含量为3.86%。

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Optimizedsynthesisof1,3-dioleoyl-2-palmitoylglycerol-richtriacylglycerolfrompalmstearinviaenzymaticacidolysis

Li Shilei1,2, Hui Ju1,2, Chu Baijun1,2, Shang Jiayi1,2, Liu Mengtao1,2, Wang Xiangyu1,2,*

1.Nutrition & Health Research Institute, COFCO Corporation (Beijing 102209)2.Beijing Key Laboratory of Nutrition & Health and Food Safety (Beijing 102209)

1,3-dioleoyl-2-palmitoylglycerol (OPO) is one of the most important components in human milk lipids. In previous research, it was usually synthesized through two-step methods. A novel one-step method was developed, in which the synthesis of OPO was catalyzed by Lipozyme RMIM, using palm stearin (m.p. = 52 ℃) as acyl acceptor and food grade oleic acid as acyl donor. The optimal reaction conditions investigated by single factor experiments are as follows: the molar ratio of palm stearin to oleic acid is 1∶10, the reaction temperature is 56 ℃, the dosage of enzyme 10% of the substrates (w/w)，the water content is 1% of the enzyme (w/w), and the reaction time is 4 h. GC analysis shows that the yields of OPO and tripalmitoylglycerol (PPP) are 45.23% and 3.68%, respectively, whereas the palmitic acid at sn-2 position is 57.73%.

1,3-dioleoyl-2-palmitoylglycerol(OPO); palm stearin; synthesis process

2017-06-25

“十三五”国家重点研发计划项目(项目编号:2017YFD0400601)；北京市科委项目(项目编号：Z171100001317004)。

李世磊，男，1987年出生，工程师，主要从事油脂加工工艺研究及产品开发工作。

*通讯作者：王翔宇，男，1984年出生，博士，主要从事油脂加工工艺研究及产品开发工作。

TS 201

A

1672-5026(2017)06-009-06

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