姜黄素预处理对肺缺血再灌注损伤大鼠的影响

吴建魏，刘洁，谭利斌，李向宇，叶飞，何强

广东省中医院麻醉科，广东 广州 510120

姜黄素预处理对肺缺血再灌注损伤大鼠的影响

吴建魏，刘洁，谭利斌，李向宇，叶飞，何强

广东省中医院麻醉科，广东 广州 510120

目的：探讨姜黄素预处理对肺缺血再灌注损伤大鼠的影响。方法：健康成年雄性SD大鼠48只，随机分为假手术组（S组）、缺血再灌注组（IR组）、姜黄素低剂量组（C50组） 及姜黄素高剂量组（C200组），每组12只。C50组和C200组分别于麻醉前2 h腹腔一次性注射姜黄素50 mg/kg和200 mg/kg，行夹闭左肺门60 min再灌注180 min。S组于麻醉前2 h腹腔注射等容量生理盐水，开胸后左肺门不进行夹闭，旷置240 min。IR组于麻醉前2 h腹腔注射等容量生理盐水，左肺门夹闭，左肺不张60 min再灌注180 min。于缺血前、再灌注60、120、180 min时采集右颈动脉血行血气分析，并计算呼吸指数（RI）。再灌注末处死动物，取肺组织，观察肺组织病理学变化并行肺损伤评分，测定肺湿干重比（W/D），检测超氧化物歧化物（SOD）和丙二醛（MDA）的含量。结果：与缺血前比较，IR组再灌注各时间点RI值显著升高（P＜0.05）。与S组比较，IR组再灌注各时间点RI值显著升高，MDA含量、W/D和肺损伤评分升高，SOD活性降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与IR组比较，C50组和C200组再灌注各时间点RI值显著降低，MDA含量、W/D和肺损伤评分降低，SOD活性升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与C50组比较，C200组再灌注各时间点RI值显著降低，MDA含量、W/D和肺损伤评分降低，SOD活性升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论：姜黄素预处理可减轻肺缺血再灌注损伤，且呈剂量依赖性，其机制可能与姜黄素减轻肺水肿，减少氧化产物的生成和增强清除氧自由基的能力有关。

肺缺血再灌注损伤；姜黄素；氧化应激；动物实验；大鼠

肺缺血再灌注损伤临床上常见于肺移植术、肺栓塞、失血性休克及体外环循等，其发病机理复杂，目前尚未完全阐明。姜黄素(CUR)是从植物姜黄、莪术、郁金等中提出的中药单体，具有广泛的药理作用：如抗缺血再灌注、抗炎以及抗氧化等[1]。已证实姜黄素对于心、脑、肾、肠等实质脏器的缺血再灌注损伤可通抗氧化应激和抗炎反应参与器官保护[2～4]。目前姜黄素对肺保护方面研究甚少，基于姜黄素以上的药理作用，也许姜黄素对肺缺血再灌注损伤也有良好的保护作用。笔者在肢体远端缺血预处理对兔肺缺血再灌注损伤的前期研究中取得良好的效果，也积累了不少的经验[5～6]。本研究旨在评价中药单体姜黄素预处理对肺缺血再灌注损伤的影响，进一步探讨姜黄素预处理肺保护的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

雄性SD大鼠48只，体质量250～300 g，大鼠饲养和实验均在广东省中医药科学院动物实验中心SPF级动物实验室内进行，合格证号为：44007200022742。随机分为4组：假手术组(S组)、缺血再灌注组(IR组)、姜黄素低剂量组(C50组)及姜黄素高剂量组(C200组)，每组12只。

1.2 仪器与试剂

动物呼吸机(美国Surgivet公司)；气管插管抗感染中心静脉导管的14号外套管(Arrow公司)；离心机(德国Heraeus公司)；酶标仪(芬兰Labsystems公司)；光学显微镜(日本Olympus公司)；无损伤血管夹(上海手术仪器厂)；紫外可见分光光度计(Unicam Heliox公司)；姜黄素和戊巴比妥钠(Sigma公司)；超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 动物模型制备

中的方法并加以改良制备肺缺血再灌注损伤模型[7]。大鼠先适应性饲养5天，术前禁食12 h，不禁水。按戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔注射进行麻醉，采用微量注射泵经尾静脉持续补液2 mL/(kg·h)(按8 mg/mL浓度用林格氏液稀释戊巴比妥钠)和维持麻醉。然后备皮，固定大鼠(仰卧位)，气管内插管(14号静脉留置针外套管)并固定，接动物呼吸机行机械通气，潮气量9～10 mL/kg，吸呼比2∶1，呼吸频率每分钟70～80次，吸入空气。分离右侧颈内动脉并置管抽血和测血气。动物转为右侧卧位，经左侧第5肋间逐层进入胸腔，暴露肺部后，钝性分离左侧肺门，尾静脉注射50 U/kg肝素抗凝。姜黄素低剂量组(C50组)和姜黄素高剂量组(C200组)分别于麻醉前2 h腹腔一次性注射姜黄素50 mg/kg和200 mg/kg，行夹闭左肺门60 min再灌注180 min。假手术组(S组)于麻醉前2 h腹腔注射等容量(2 mL)生理盐水，开胸后左肺门不进行夹闭，旷置240 min。缺血再灌注组(IR组)于麻醉前2 h腹腔注射等容量(2 mL)生理盐水，左肺门夹闭，左肺不张60 min再灌注180 min。缺血期间，切口处覆盖生理盐水湿润后的纱布，外用塑料薄膜覆盖，减少水份蒸发。应用白炽灯泡加热维持大鼠肛温于37～38℃。

1.4 标本采集与指标测定

(1)于缺血前、再灌注60、120、180 min时采集右颈动脉血行血气分析，并计算呼吸指数(RI)=P(A-a)DO2/PaO2。(2)肺湿干重比(W/D)：于再灌注末放血处死大鼠，移除的左肺被即刻分成3个部分。左侧肺上1/3用盐水漂洗，滤纸吸干，称重为湿重，烘箱内70℃烘干24 h至重量不再变化后称重为干重，计算W/D。(3)肺组织形态学变化：左肺中部(第2部分)2 mm厚组织块浸在10%福尔马林液固定，常规石蜡包埋，HE染色，观察光镜下肺组织病理学改变，其病理评分基于以下变量：肺泡和肺间质水肿，炎症细胞浸润以及出血，严重程度评分如下：无损伤=1分，损伤25%=2分，损伤50%=3分，损伤75%=4分，弥漫性损伤=5分。其它肺组织(第3部分)放入冻存管置液氮罐保存，然后存入-80℃冰箱待用。(4)超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)测定：取冻存的肺组织，加入生理盐水制成质量分数为10%的组织匀浆，分别采用黄嘌呤氧化酶法与硫代巴比妥酸法测定SOD的活性和MDA的含量，详细步骤按试剂盒说明书操作。

1．5 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠肺组织病理学比较 见图1。与S组比较，IR组肺泡壁明显增厚，肺泡、肺间质水肿明显，大量炎性细胞浸润，红细胞渗出明显，肺组织损伤明显；C50组肺组织损伤较IR组减轻，但还有少量细胞渗出，肺间质和肺泡水肿有所缓解；C200组肺组织形态结构未见明显异常，轻度肺间质水肿。

图1 各组大鼠肺组织病理学HE染色结果 (×400)

2.2 各组大鼠血气PaO2、P（A-a）DO2及RI的变化比较见表1。缺血前各组RI差异无统计学意义(P＞0.05)。与缺血前比较，IR组再灌注各时间点RI值显著升高，差异均有统计学意义(P＜0.05)。与S组比较，IR组再灌注各时间点RI值显著升高，差异均有统计学意义(P＜0.05)。与IR组比较，C50组和C200组再灌注各时间点RI值显著降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)。与C50组比较，C200组再灌注各时间点RI值显著降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)。

表1 各组大鼠血气PaO2、P(A-a)DO2及RI的变化比较(±s，n=12)

表1 各组大鼠血气PaO2、P(A-a)DO2及RI的变化比较(±s，n=12)

与缺血前比较，①P＜0.05；与S组比较，②P＜0.05；与IR组比较，③P＜0.05；与C50组比较，④P＜0.05

组别 指标 缺血前 再灌注(min)S组IR组C50组C200组S组IR组C50组C200组S组IR组C50组C200组PaO2(mmHg)P(A-a)DO2(mmHg)RI 91.83±8.51 89.33±6.77 91.37±8.15 91.67±9.25 15.67±1.05 21.83±4.74 19.33±4.12 19.43±5.31 0.19±0.08 0.25±0.02 0.23±0.08 0.21±0.07 60 89.33±8.12 62.67±12.47①②80.83±15.13③84.83±25.13③④29.33±6.09 49.00±10.48①②39.17±2.54③29.67±3.69③④0.33±0.08 0.85±0.13①②0.58±0.21③0.44±0.11③④120 85.17±7.65 67.33±11.71①②79.27±15.42③83.67±17.91③④25.67±6.31 43.33±10.65①②35.19±5.89③25.17±7.83③④0.31±0.09 0.65±0.12①②0.48±0.08③0.37±0.07③④180 86.33±3.83 69.67±17.80①②81.06±10.36③87.00±20.35③④25.67±4.03 38.00±11.03①②30.04±7.37③26.03±8.33③④0.30±0.05 0.59±0.11①②0.51±0.05③0.41±0.05③④

2．3 各组大鼠肺组织SOD活性、MDA含量、W/D和肺损伤评分比较 见表2。与S组比较，IR组MDA含量、W/D和肺损伤评分升高，SOD活性降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)。与IR组比较，C50组和C200组MDA含量、W/D和肺损伤评分降低，SOD活性升高，差异均有统计学意义(P＜0.05)。与C50组比较，C200组MDA含量、W/D和肺损伤评分降低，SOD活性升高，差异均有统计学意义(P＜0.05)。

表2 各组大鼠肺组织SOD活性、MDA含量、W/D和肺损伤评分比较(±s，n=12)

表2 各组大鼠肺组织SOD活性、MDA含量、W/D和肺损伤评分比较(±s，n=12)

组别S组IR组C50组C200组SO D(U/mg)97±6 52±16①81±3②92±9②③M D A(nmol/mg)3.61±0.17 8.84±1.35①5.06±0.36②4.07±0.47②③W/D 2.12±0.36 4.69±1.94①3.05±0.18②2.35±0.32②③肺损伤评分(分)1.53±0.28 6.71±0.88①3.14±0.22②2.11±0.17②③

与S组比较，①P＜0.05；与IR组比较，②P＜0.05；与C50组比较，③P＜0.05

3 讨论

姜黄，始载于《唐本草》，具有破血行气、通经止痛等功效，以姜科植物姜黄的干燥根茎入药，近年来研究不仅证明了其传统的药效，而且还发现了一些新的药理特性，如抗缺血再灌注损伤、抗炎、抗肿瘤、抗HIV、抗纤维化、对代谢的影响等作用[8]，显示了其广阔的应用前景。

本研究中，与假手术组比较，缺血再灌注组再灌注各时点PaO2明显降低，P(A-a)DO2升高，RI显著升高，肺组织损伤评分和W/D明显升高，并且出现肺组织水肿明显，大量炎性细胞浸润，红细胞渗出明显；而且在缺血再灌注组中，与缺血前比较，再灌注各时点PaO2明显降低，P(A-a)DO2升高，RI显著升高，表明肺缺血60 min再灌注180 min并发的肺损伤模型制备成功。本研究结果显示，与缺血再灌注组比较，姜黄素高、低剂量组中RI、W/D、肺组织损伤评分、以及病理形态改变明显降低，提示姜黄素预先给药可减轻大鼠肺缺血再灌注损伤，且呈剂量依赖性。

氧化应激主要以产生活性氧簇(ROS)多少来反映，正常机体内的ROS的产生与清除趋向平衡[9]。目前已清楚氧化应激在缺血再灌注损伤模型中起到关键作用[10]。正常情况下，机体内存在大量的抗氧化物质，活性氧能得到有效控制，从而保障机体生理功能的正常运转。缺血再灌注损伤中一个重要的导致ROS产生的机制，是次黄嘌呤的产生和低氧状况下黄嘌呤脱氢酶到黄嘌呤氧化酶的转变，再氧合后，次黄嘌呤降解为超氧化物，在这个过程中超氧化物起到了主要作用。SOD活性可以反映清除氧自由基的能力，而MDA是脂质氧化代谢产物之一，可间接的反映氧自由基的产生情况。本研究中，缺血再灌注组中MDA含量明显较其他组高，SOD活性反之，提示肺缺血再灌注时氧自由基产生明显增加，清除能力显著降低，而通过姜黄素预处理后，机体的抗氧化能力增强，氧自由基生成也减少。

RI是指肺泡动脉氧分压差与动脉氧分压之比P(A-a)DO2/PaO2，是反映肺的通气、氧交换功能的一个简单而实用的指标，评价机体氧合好坏优于PaO2和PaO2/FiO2。研究认为，RI指数越大，肺的氧合越差，肺气体交换功能就越差[11]。肺湿干重比(W/D)是反映肺组织的含水量的，可间接的反映肺毛细血管的通透性。当肺缺血再灌注损伤时，肺毛细血管膜受损，通透性增加，血管内渗出液增多，肺组织水肿，肺的气体交换功能严重障碍。结合肺组织病理学改变，肺缺血再灌注时，肺泡结构破坏，肺泡、肺间质水肿明显，大量炎性细胞浸润，红细胞渗出明显，肺组织损伤明显。本研究结果显示，与缺血再灌注组比较，姜黄素低剂量组和姜黄素高剂量组RI、W/D和肺损伤评分降低。与姜黄素低剂量组比较，姜黄素高剂量组RI、W/D和肺损伤评分降低，表明姜黄素预先给药可减轻大鼠肺缺血再灌注损伤，且呈剂量依赖性，从而实现肺保护。

综上所述，姜黄素预先给药可减轻大鼠肺缺血再灌注损伤，且呈剂量依赖性，其机制可能与姜黄素减轻肺水肿，减少氧化产物的生成和增强清除氧自由基的能力有关。

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[10]Minutoli L，Puzzolo D，Rinaldi M，et al．ROS-Mediated NLRP3 inflammasome activation in brain， heart， kidney，and testis ischemia/reperfusion injury[J]．Oxid Med Cell Longev，2016：2183026．

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Curcumin Pretreatment Has Effect on Rats with Lung Ischemia Reperfusion Injury

WU Jianwei，LIU Jie，TAN Libin，LI Xiangyu，YE Fei，HE Qiang

Objective：To discuss the effect of curcumin pretreatment on rats with lung ischemia reperfusion injury.Methods：Divided 48 healthy adult male SD rats into sham operation group(group S)，ischemia reperfusion group(group IR)，low-concentration curcumin group(group C50)and high-concentration group(group C200)randomly，12 rats in each group.Group C50 and group C200

disposablel abdominal injection of curcumin(50 mg/kg and 200mg/kg respectively)2 h before anesthesia，occluding left pulmonary hilus for 60 min and reperfusing for 180 min.Group S received abdominal injection of equivalent saline 2 h before anesthesia，no occlusion of the left pulmonary hilus after opening chest，and was put aside for 240 min.Group IR received abdominal injection of equivalent saline 2 h before anesthesia，occluding leftpulmonary hilus for 60 min and reperfusing for 180 min.Before ischemia and in the 60th，120th and 180th min of reperfusion，collected the blood of right carotid artery to conduct a blood gas analysis，and calculated the respiratory index(RI).In the end of reperfusion，the rats were sacrificed for collecting the pulmonary tissue.Observed the pathological changes of the pulmonary tissue，measured wet-dry weight ratio(W/D)，detected the content of superoxide dismutase(SOD)and malondialdehyde(MDA).Results：Comparing with that before ischemia，RI of the group IR in each time point of reperfusion was significantly increased(P＜ 0.05).Comparing with that of group S，RI of the group IR in each time point of reperfusion was significantly increased，the content of MDA，W/D and scores of pulmonary injury were higher，while the activation of SOD was lower，differences being significant(P＜ 0.05).Comparing with that of group IR，RI of the group C50 and group C200 in each time point of reperfusion wassignificantly decreased，the content of MDA，W/D and scores of pulmonary injury were lower，while the activation of SOD washigher，differences being significant(P＜ 0.05).Comparing with that of group C50，RI of the group C200 in each time point of reperfusion was significantly decreased，the concentration of MDA，W/D and scores of pulmonary injury were lower，while the activation of SOD was higher，differences being significant(P＜ 0.05).Conclusion：Curcumin pretreatment can release lung ischemia reperfusion injury in a dose-dependent manner，and the mechanism may be relevant with its curcumin of releasing pulmonary edema，reducing the formation of oxidation products and enhancing the function of clearing oxygen free radicals.

Lung ischemia reperfusion injury；Curcumin；Oxidative stress；Animal experiment；Rats

R56

A

0256-7415（2018）01-0007-04

10.13457/j.cnki.jncm.2018.01.002

2017-06-12

广东省中医药局项目（20152146）

吴建魏（1977-），男，主治医师，主要从事脏器保护方面的研究。

冯天保，郑锋玲）