HPLC法对决明子中3种有效成分含量的测定

张梅，冯良，潘娜

1.郑州市妇幼保健院，河南 郑州 450000；2.河南中医药大学第三附属医院，河南 郑州 450000

HPLC法对决明子中3种有效成分含量的测定

张梅1，冯良2，潘娜1

1.郑州市妇幼保健院，河南 郑州 450000；2.河南中医药大学第三附属医院，河南 郑州 450000

目的：高效液相色谱法测定决明子中红镰霉素龙胆二糖苷、决明子苷C及橙黄决明素-6-O-β-D-葡萄糖苷3种有效成分的含量。方法：采用Zorbax Eclipse XDB-C18色谱柱，柱温30℃，以乙腈和四氢呋喃混合溶液（A）-1%冰醋酸（B）（A∶B=30∶70）为流动相等度洗脱，流速1.0 mL/min，检测波长为278 nm。结果：3种有效成分得到了基线分离。红镰霉素龙胆二糖苷、决明子苷 C 及橙黄决明素-6-O-β-D-葡萄糖苷分别在 0.136 4～1.091 μg、0.117 9～0.943 μg、0.126 3～1.010 μg 与相应的峰面积呈现良好的线性关系，回归方程分别为Y=3.78×106X-143 929、Y=2.67×106X-78 435、Y=3.15×106X-108 435；平均加样回收率分别为100.53%、98.95%、102.30%。对不同产地决明子药材进行测定，结果显示3种有效成分的含量差异较大。结论：经过方法学验证，本方法准确、可靠、重复性好，可以为决明子药材评价与质量控制提供有效参考。

决明子；红镰霉素龙胆二糖苷；决明子苷C；橙黄决明素-6-O-β-D-葡萄糖苷；含量测定

决明子，又称草决明、决明，为豆科植物决明或小决明的干燥成熟种子，味甘、苦、咸，性微寒，具有清肝明目、润肠通便的功效[1]。现代医学研究显示，决明子主要有效成分为蒽醌类和萘并吡喃酮类，药理作用主要包括降血脂[2]、调血压[3～4]、保肝[5]及抑菌[6]、抗氧化[7]等，在各种降脂减肥的制剂中广泛应用。目前，决明子药材的质量控制标准一般采用提取步骤繁琐的游离蒽醌类成分为指标，忽略了同样具有生物活性、含量较高的萘并吡喃酮类化合物[8]。为了对决明子进行更好的质量控制，本研究采用HPLC法建立了3种有效成分红镰霉素龙胆二糖苷、决明子苷C及橙黄决明素-6-O-β-D-葡萄糖苷的含量分析方法，并选取了三个主要产地的决明子药材进行测定，为进一步完善决明子药材的质量控制和评价体系提供依据和参考。

1 材料

1.1 仪器

高效液相色谱仪(G1312B型泵，G1329A型自动进样器，G1316A型柱温箱，G1314B型检测器，Agilent Chemstation仪器控制及数据处理系统，德国安捷伦公司)。Sartioms 2004MP型十万分之一电子分析天平。

1.2 药品与试剂

红镰霉素龙胆二糖苷、决明子苷C及橙黄决明素-6-O-β-D-葡萄糖苷对照品为自制，经HPLC检测，面积归一化法计算纯度大于98%；决明子供试品药材购于中国药品生物制品检定所。各产地药材样品购自于其省市药材市场或药店。乙腈为HPLC级，甲醇为色谱级，两者均购自Fisher公司；四氢呋喃、冰醋酸为色谱纯，其余试剂均为分析纯，购自北京百灵威科技有限公司；纯净水由Milli-Q超纯水制备系统制备。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Zorbax Eclipse XDB-C18色谱柱(250×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈 -四氢呋喃(90∶10)混合溶液(A)-1%冰醋酸(B)，A相∶B相为30∶70；流速 1.0 mL/min，柱温30℃，检测波长278 nm，进样量10 μL。在此色谱条件下，对照品和决明子供试品中红镰霉素龙胆二糖苷、决明子苷C及橙黄决明素-6-O-β-D-葡萄糖苷的色谱峰与其他非检测成分峰达到基线分离，无干扰，对照品与供试品的色谱图见图1。

图1 对照品(A)和决明子供试品(B)的液相色谱图

2.2 对照品溶液的配制

2.2.1 单一对照品储备液的配制 分别精密称取红镰霉素龙胆二糖苷、决明子苷C及橙黄决明素-6-O-β-D-葡萄糖苷各5 mg，各置于10 mL量瓶中，分别加90%甲醇溶解并定容至刻度，配制成红镰霉素龙胆二糖苷浓度0.545 5 g/L、决明子苷C 0.471 5 g/L、橙黄决明素-6-O-β-D-葡萄糖苷0.505 0 g/L的单一对照品储备液。

2.2.2 混合对照品溶液的配制 精密吸取2.2.1中3个对照品储备液各0.5 mL于5 mL量瓶中，并加90%甲醇稀释至刻度，摇匀配制成含红镰霉素龙胆二糖苷浓度0.054 55 g/L、决明子苷C 0.047 15 g/L、橙黄决明素-6-O-β-D-葡萄糖苷0.050 50 g/L的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

将决明子药材样品粉碎，过60目筛，精密称取0.2 g，置于圆底烧瓶中，准确加入25 mL 90%甲醇，称量重量后加热回流2 h，放至室温，再称重，用90%甲醇补足减失的质量，过滤并弃去初滤液，取续滤液适量过0.45 μm微孔滤膜后为供试品溶液。

2.4 线性关系考察

见表1。分别精密吸取2.2.2中混合对照品溶液2.5，5，10，15，20 μL进样，测定并记录峰面积。以进样量(μg)为横坐标(X)、以峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，红镰霉素龙胆二糖苷、决明子苷C及橙黄决明素-6-O-β-D-葡萄糖苷回归方程分别为Y=3.78×106X-143 929、Y=2.67×106X-78 435、Y=3.15×106X-108 435，线性范围分别为0.136 4～1.091 μg、0.117 9～0.943 μg、0.126 3～1.010 μg。

表1 回归方程与线性范围

2.5 精密度试验

见表2。精密吸取2.2.2中混合对照品溶液10 μL，连续重复进样6次，在2.1色谱条件下连测3天，测定并记录峰面积，分别以红镰霉素龙胆二糖苷、决明子苷C及橙黄决明素-6-O-β-D-葡萄糖苷色谱峰峰面积计算精密度，三种有效成分的日内精密度、日间精密度均小于3%，表明仪器检测的精密度良好。

表2 精密度试验结果 %

2.6 稳定性试验

精密称取同一样品0.2 g，按2.3步骤制备供试品溶液，在2.1色谱条件下，分别在0、1、2、4、8、12、24 h取供试品溶液 10 μL进样测定，记录3种被测成分各次检测的峰面积，计算RSD。结果红镰霉素龙胆二糖苷、决明子苷C及橙黄决明素-6-O-β-D-葡萄糖苷在24 h内峰面积的RSD分别为1.9%、1.4%、1.6%。表明样品在24 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验

精密称取6份同一批次决明子样品粉末(过60目筛)，每份0.2 g，按2.3中步骤制备供试品溶液，在2.1色谱条件下吸取10 μL进样测定，记录各峰面积，并分别计算红镰霉素龙胆二糖苷、决明子苷C及橙黄决明素-6-O-β-D-葡萄糖苷含量的RSD分别为1.9%、2.6%、2.4%，表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

见表3。精密称取6份已知含量的决明子样品粉末(过60目筛)，每份0.05 g，分别加入2.2.1中单一对照品储备溶液红镰霉素龙胆二糖苷0.55 mL、决明子苷C 0.45 mL及橙黄决明素-6-O-β-D-葡萄糖苷1.2 mL，按2.3中步骤制备供试品溶液，在2.1色谱条件下吸取10 μL进样测定，回收率=(测得量-样品中含量)/加入量，红镰霉素龙胆二糖苷、决明子苷C及橙黄决明素-6-O-β-D-葡萄糖苷的平均加样回收率分别为100.53%、98.95%、102.30%。

表3 加样回收率试验结果（n=6）

2.9 决明子药材样品含量测定

见表4。分别精密称取3个不同地区决明子药材粉末(过60目筛)，按2.3中步骤制备供试品溶液，在2.1色谱条件下吸取10 μL进样测定，记录色谱峰面积并计算含量。

表4 不同地区决明子药材含量测定结果（n=3） %

3 讨论

本研究比较了热回流提取法、超声提取法及冷浸提取法3种不同的提取方法，结果发现热回流提取法对蒽醌苷类和萘并吡喃酮苷两类物质同时提取的效果相对较好；在此基础上进一步比较了70%甲醇、90%甲醇及纯甲醇3种溶剂的提取效率，同时也比较了1 h、2 h、3 h、4 h时的提取效率，结果发现用90%甲醇提取效果较好，且2 h时有效成分已提取完全，因此选择90%甲醇溶液热回流提取2 h作为最终的提取方法。此外，本研究比较了乙腈-水溶液、乙腈-1%冰醋酸水溶液、乙腈和四氢呋喃混合溶液-1%冰醋酸水溶液等3个不同流动相系统的分离效果，结果发现乙腈四氢呋喃(90∶10)混合溶液-1%冰醋酸水溶液等度洗脱对所测有效成分达到基线分离，效果较好。

本研究建立了HPLC法同时检测决明子药材中红镰霉素龙胆二糖苷、决明子苷C及橙黄决明素-6-O-β-D-葡萄糖苷3种成分含量的方法，方法学试验结果表明，该方法简单准确，重复性良好，样品加样回收率较好，没有酸水解步骤，可用做决明子药材质量标准与控制的方法之一。

本研究应用该方法对3个不同产地决明子药材中红镰霉素龙胆二糖苷、决明子苷C及橙黄决明素-6-O-β-D-葡萄糖苷含量进行了测定，结果发现不同产地决明子药材中三种成分含量有较大差异，考虑到此三种成分含量均较高，且具有一定生物活性，可以选取其作为体现决明子药材特征与品质的指标，为决明子药材标准规范化提供参考。

[1]卢金清，黎强，李肖爽，等．决明子研究进展[J]．湖北中医药大学学报，2014，16(4)：124-126．

[2]张喜，董慧．决明子及其主要成分治疗高血脂症的研究进展[J]．现代中西医结合杂志，2014，23(35)：3972-3974．

[3]于海荣，王一帆，陈建双．决明子蒽醌苷对两肾一夹高血压大鼠左室心肌肥厚及舒张功能的影响[J]．中国老年学杂志，2017，37(1)：34-35．

[4]何冰心．川芎决明方合硝苯地平治疗高血压病30例[J]．陕西中医，2007，28(10)：1296-1297．

[5]李博萍，陈依雨，潘竞锵，等．决明子提取物对高脂-高果糖诱导非酒精性脂肪肝大鼠的调脂保肝作用[J]．海峡药学，2015，27(9)：21-24．

[6]王立英，王艳珍，吴丽艳，等．响应面法优化超临界CO_2萃取决明子挥发油工艺及其抑菌活性研究[J]．药物分析杂志，2016，36(4)：594-601．

[7]赵红岩．决明子生品中游离蒽醌的提取工艺优化和抗氧化活性分析[J]．农产品加工，2015(7)：30-32．

[8]张小梅，杨荣平，励娜，等．决明子中蒽醌类成分的含量测定[J]．时珍国医国药，2007，18(1)：97-98．

Determination of Content of Three Effective Components in Cassia Seed with HPLC

ZHANG Mei，FENG Liang，PAN Na

Objective：To establish methods of high performance liquid chromatograph(HPLC)so as to determine content of rubrofusarin gentiobioside，assiaside C and Aurantio-obtusifolin-6-O-β-D-glucopyranoside of cassia seed.Methods：Performed Zorbax Eclipse XDB-C18 column at the temperature of 30℃，and used acetonitrile and tetrahydrofuran(A)-1%acetic acid(B)(A∶B=30∶70)as mobile phase by isocratic elution，with the flow rate being 1.0 mL/min and detection wavelength at 278 nm.Results：Three effective components achieved a baseline resolution.Rubrofusarin gentiobioside，assiaside C and Aurantio-obtusifolin-6-O-β-D-glucopyranoside respectively demonstrated a good linear relationship with the peak area in the range of 0.136 4～1.091 μg，0.117 9～0.943 μg，and 0.126 3～1.010 μg.The respective typical equation was Y=3.78×106X-143 92，Y=2.67×106X-784 35，Y=3.15×106X-108 435 respectively，and their average recovery was 100.53%，98.95%and 102.30% respectively.For the determination of cassia seed from different habitats，the result indicated there was great difference among the content of these three effective components.Conclusion：By methodologyverification，the determination method is accurate，reliable，and of good reproducibility.It can be an effective reference to the evaluation and quality control of cassia seed.

2017-05-19

张梅（1983-），女，主管中药师，研究方向：中药学及医院药学。

Cassia seed；Rubrofusarin gentiobioside；Assiaside C；Aurantio-obtusifolin-6-O-β-D-glucopyranoside；Content determination

R284.1

A

0256-7415（2018）01-0015-04

10.13457/j.cnki.jncm.2018.01.004

冯天保，郑锋玲）