电针对围绝经期抑郁症大鼠海马神经元凋亡的影响❋

荆 秦，林 卉，任 路

(辽宁中医药大学针灸推拿学院，沈阳 110847)

【针灸研究】

电针对围绝经期抑郁症大鼠海马神经元凋亡的影响❋

荆 秦，林 卉，任 路△

(辽宁中医药大学针灸推拿学院，沈阳 110847)

目的：研究电针对围绝经期抑郁症大鼠海马神经元凋亡的影响，探讨其治疗抑郁症的作用机制。方法：将48只雌性SD大鼠随机分为空白组、模型组、药物组和电针组各12只；采用去势和慢性不可预见性应激制备围绝经期抑郁症大鼠模型，药物组采用盐酸氯米帕明灌胃，电针组选择“百会”“三阴交”和“肾俞”。检测阴道图片，比较大鼠强迫游泳不动时间，采用ELISA法检测大鼠海马DA、5-HT和Caspase-3含量，通过尼氏染色法观察DG区神经细胞的病理变化。结果：与模型组比较，电针组和药物组强迫游泳不动时间明显缩短；海马DA和5-HT含量升高，Caspase-3蛋白表达降低，DG区神经细胞数目增多，胞浆内尼氏小体总面积、积分光密度和平均黑度均升高，差异有统计学意义。结论：电针疗法明显改善大鼠的抑郁症状，阻止神经细胞的凋亡，促进大鼠海马神经细胞的修复和新生。

围绝经期抑郁症；神经递质；Caspase-3；尼氏小体；细胞凋亡

围绝经期抑郁症是在围绝经期发生的一种精神疾病，常发生在绝经前5～10年，平均年龄为47.5岁。围绝经期出现不同程度的内分泌、躯体和心理方面的变化，以情感忧郁、焦虑和紧张为主要临床表现。随着社会的发展，其发病率逐年上升，已成为生物-心理-社会医学模式的一种典型代表。据统计，在发达国家抑郁症发病率可达26%～33%[1]。目前，国内外西医治疗围绝经期综合征的主要方法是激素疗法，此疗法得到广泛认可，但许多研究表明长期使用可增加乳腺癌等疾病发生的风险[2]。近年来，中医学者越来越关注围绝经期综合征，其治疗立足于整体治疗，调节脏腑功能，且副作用少可以长期应用。本实验选用围绝经期抑郁症大鼠模型，检测海马组织多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)和半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3(Caspase-3)含量，计算海马齿状回(DG区)神经细胞和尼氏小体数量以观察神经元功能状态，从海马神经元凋亡这一角度探讨电针对围绝经期抑郁症的作用机理。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

选用SPF级SD大鼠48只，17周龄，均为雌性，体质量(200±20) g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供(许可证号SCXK(京)2012-0001)，所有大鼠给予适应性喂养21 d(辽宁中医药大学SPF级动物实验室)。采用随机数字表法将48只大鼠分为空白组、模型组、药物组和电针组各12只，实验过程中对动物的处置符合《关于善待实验动物的指导性意见的规定》[3]。

1.2 试剂与仪器

试剂：盐酸氯米帕明片25 mg/片(江苏恩华药业股份有限公司生产，生产批号20140104)，1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)，10%水合氯醛(北京索莱宝股份有限公司)，无水乙醇(天津市大茂化学试剂厂)，吉姆萨染色液(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)，青霉素(华北制药股份有限公司，生产批号F4041108)，酶联免疫试剂盒(ameko购于上海岚派生物科技有限公司)，C01117尼氏染色液。

仪器：805-AⅡ型电针治疗仪(广东汕头市医用设备厂)，LEICA DMLS2显微镜(德国，Leica公司生产)，DFC500数码成相软件(德国，Leica公司),酶标仪(Gnth52010)，华佗牌针灸(0.25×25 mm，苏州医疗用品厂有限公司)，强迫游泳系统(自制)。

1.3 模型制备

本实验除空白组外，其余大鼠采用双侧卵巢切除结合慢性不可预见性应激建立围绝经期抑郁症大鼠模型。

1.3.1 卵巢切除术 大鼠以腹位置于固定台上，用1%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉，以最后肋骨稍后方为中心剪毛，消毒后自腰椎沿背部正中线向下做纵行切口约1～2 cm，切开皮肤和背肌，在背中线侧方约1 cm处向腹腔方向分离肌肉。打开腹膜，用镊子夹起位于腹膜下的卵巢分离脂肪团，结扎卵巢下输卵管，切除双侧卵巢[4]。将其余组织重新恢复于腹腔内，以80万单位青霉素溶于5 ml生理盐水，滴入配好的青霉素2～3滴，将腹膜与肌肉层缝合，最后缝合皮肤。

1.3.2 慢性不可预见性应激 卵巢切除术后，全部大鼠接受21 d慢性不可预见性应激[5]。刺激包括夹尾(用止血钳夹住距大鼠尾尖1 cm处1 min)、热应(45 ℃，5 min)、冰水游泳(4 ℃，5 min)、束缚限制行动(1 h)、禁食禁水(24 h)、潮湿垫料并倾斜鼠笼(24 h)和昼夜颠倒(24 h)7种，每只大鼠每天随机选择1种刺激，连续2 d不能给予同样刺激，每种刺激平均使用3次。

1.4 干预方法

空白组和模型组大鼠正常饲养不接受刺激。造模21 d后药物组使用盐酸氯米帕明灌胃，将药片碾碎后溶于0.9%生理盐水中，每天以20 mg/kg灌胃1次，连续28 d。电针组针刺百会、肾俞和三阴交，取穴方法参照普通高等教育“十五”国家级规划教材《实验针灸学》，施针后连接电针仪，毫针电极(负载 250Ω)0～18 V，选用疏密波，疏波4 Hz，密波20 Hz，以穴位皮肤肌肉轻微抽动为度，留针20 min，每天1次，连续28 d。

1.5 样品采集

干预结束后统计各组大鼠情况，造模过程中大鼠共死亡8只。剩余的40只大鼠用10%水合氯醛麻醉，剥离大鼠腹主动脉使其失血死亡后，剪开大鼠颅骨放在冰盒上，切掉小脑及周边组织，分离海马组织，匀浆后离心10 min(3000 r/min)，吸取上清液，放入-80 ℃冰箱保存备用。

1.6 观察指标及检测方法

1.6.1 阴道涂片 卵巢切除术后，第4、5、6、7、8天逐只进行阴道涂片检查，以不出现动情期反应确定卵巢摘除完全为造模成功[6]。

1.6.2 强迫游泳实验 在安静的室内选用一个40 cm×60 cm黑色塑料桶，桶壁光滑，每只桶内放入1只大鼠，加水液面距离桶沿10～15 cm，大鼠浮在水中时四肢不能借助桶壁的力量。大鼠最初表现为在水中游动和剧烈挣扎并试图逃脱，逃脱失败后将头露出水面并肢体漂浮，不再挣扎和游泳，保持静止不动状态称为“行为绝望”[7]。实验时间为6 min，前3 min让大鼠适应游泳的环境，记录后3 min内大鼠保持静止状态的时间，静止不动时间说明大鼠的绝望程度。

1.6.3 测定含量 采用酶联免疫吸附法(ELISA法)检测海马组织DA、5-HT和Caspase-3蛋白含量，试剂盒购自上海岚派生物科技有限公司，试剂配制和检测操作按照试剂盒说明书进行。每只大鼠随机选取3张海马组织切片，观察海马3个不重叠连续视野(×400), 用捷达801形态学图像分析系统统计神经细胞数目以及神经细胞浆内尼氏小体总面积、积分光密度和平均黑度。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 阴道涂片结果

图1显示，空白组大鼠动情前期以有核上皮细胞为主；动情期以不规则的角化上皮细胞为主；动情后期不规则的角化上皮细胞、有核上皮细胞和白细胞同时可见；动情间期细胞总数较稀少，以白细胞为主。卵巢切除后，连续5 d检测阴道涂片未见任何动情周期变化，说明大鼠去势成功。

图1 空白组大鼠阴道涂片染色结果

2.2 电针对大鼠强迫游泳不动时间的影响

表1显示，造模前，各组大鼠强迫游泳时间差异无统计学意义(P>0.05)。造模后，各组大鼠强迫游泳不动时间明显延长，与空白组比较差异有统计学意义(P<0.05)；治疗后,药物组和电针组强迫游泳不动时间明显缩短，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 各组大鼠强迫游泳不动时间结果比较

注：与空白组比较：*P<0.05；与模型组比较：△P<0.05

2.3 电针对大鼠海马神经递质含量的影响

表2显示，造模后DA和5-HT含量明显降低，与空白组比较差异有统计学意义(P<0.05)。经过28 d治疗，药物组和电针组DA和5-HT含量明显升高，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 各组大鼠海马神经递质含量结果比较

注：与空白组比较：*P<0.05；与模型组比较：△P<0.05

2.4 电针对大鼠海马Caspase-3蛋白表达影响

表3显示，造模后Caspase-3蛋白表达升高，与空白组比较差异有统计学意义(P<0.05)。经过28 d治疗，药物组和电针组Caspase-3蛋白表达均降低，且电针组Caspase-3蛋白表达低于药物组；与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

表3 各组大鼠海马Caspase-3蛋白表达结果比较

注：与空白组比较：*P<0.05；与模型组比较：△P<0.05

2.5 电针对大鼠海马DG区神经元的影响

表4显示，造模后海马DG区神经细胞数量减少，尼氏小体总面积、积分光密度和平均黑度均降低，与空白组比较差异有统计学意义(P<0.05)。经过28 d治疗，药物组和电针组DG区神经细胞数量增多，尼氏小体总面积、积分光密度和平均黑度均增加，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

表4 各组大鼠海马DG区神经细胞计数、尼氏小体总面积、积分光密度和平均黑度结果比较

注：与空白组比较：*P<0.05；与模型组比较:△P<0.05

3 讨论

中医古籍中无围绝经期抑郁症的记载，其描述多见于“郁证”“脏躁”等病证。《灵枢·海论》曰：“脑为髓之海。”肾主骨生髓通脑，《类证治裁》曰:“使之神明下通于肾，肾之精华上升于脑，精能生气，气能生神，神定气消。”先天之精充足，上益于髓海，心神得养。若肾精不足，则髓海空虚，导致脑的精神意识功能失常，出现抑郁等情志异常疾病。本实验从“肾脑相济”角度出发，选取肾俞、三阴交和百会。肾俞为背俞穴，可益肾填精；三阴交为肝、脾及肾三经交会穴，可调理肝、脾、肾三脏，使气血充盛；百会属督脉，居于巅顶，为诸阳之会，三穴相合具有补肾益脑、安神解郁作用。

目前研究发现，抑郁症患者存在海马损害，且与海马神经细胞凋亡增加有关[8-9]。中医所说的脑髓相当于现代医学的脑内神经元[10]，脑内神经元细胞萎缩和凋亡即可造成髓海不足。海马是边缘系统的重要组成部分，内存大量神经干细胞及5-HT、DA等神经递质,对应激最为敏感，神经递质的平衡失调在情感调节活动中具有重要作用。研究表明，在应激过程中海马的结构和功能产生损伤，可导致情志疾病的发生[11]。Caspase家族是直接导致细胞解体凋亡的蛋白酶系统，是多条细胞凋亡途径的交汇点。在外来刺激下，Caspase家族起始蛋白被激活，激活后执行蛋白水解靶蛋白，最终导致细胞解体凋亡，即Caspase过度表达可导致细胞凋亡[12]。其中，Caspase-3被称为“死亡蛋白酶”，是细胞凋亡的执行蛋白，与细胞凋亡关系最密切。尼氏小体广泛存在于神经元的胞体和树突中，其功能是合成高级神经活动所需的蛋白质。神经元在兴奋传导过程中，不断消耗蛋白质，需要尼氏小体合成新的蛋白质以补充消耗[13]，故尼氏小体与神经元的功能关系密切[14]。正常情况下, 尼氏小体数量多,说明神经细胞合成蛋白质的功能强。本文选择检测海马组织中5-HT和DA的含量，通过Caspase-3蛋白表达和尼氏小体的数量形态反应神经元的功能活性。

本实验采用去势手术模拟围绝经期综合征，该方法周期短、简单易行，是公认的一种围绝经期综合征造模方法，同时结合慢性不可预见性应激制备围绝经期抑郁症大鼠模型。造模后，发现大鼠强迫游泳的不动时间延长，提示大鼠绝望无助行为增加；检测大鼠海马组织中DA和5-HT含量降低，表明大鼠处于抑郁状态，即围绝经期抑郁症大鼠造模成功。检测Caspase-3蛋白表达升高，提示抑郁通过激活下游凋亡执行蛋白Caspase-3而产生细胞凋亡，观察海马DG区发现神经细胞数量减少，尼氏小体总面积、积分光密度和平均黑度均降低，说明抑郁模型大鼠海马细胞损伤，凋亡增多。经药物和电针治疗后，大鼠绝望无助行为减少，海马组织内DA和5-HT含量升高，表明大鼠抑郁症状明显改善；Caspase-3蛋白表达降低，海马DG区神经细胞数量增多，尼氏小体总面积、积分光密度和平均黑度均升高，说明海马内细胞凋亡减少，神经元活性增强，具有类似于神经营养因子的保护作用，反映出围绝经期抑郁症与神经细胞凋亡关系密切。

综上所述，本实验结果显示电针疗法通过抑制海马神经元细胞的凋亡，促进神经元功能恢复以改善大鼠抑郁状态，其效果优于盐酸氯米帕明。

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EffectofElectroacupunctureonNeuronalApoptosisinTheHippocampalofPerimenopausalDepressionRat

JING Qin, LIN Hui, REN Lu△

(SchoolofAcu-moxibustionandTuina,LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine，Shenyang110847，China)

Objective: To evaluate the effect of electroacupuncture(EA) therapy on neuronal apoptosis in the hippocampal of depression rat model, and investigate its pharmacological mechanisms in depression treatment. Methods: Forty-eight male SD rats were randomly divided into 4 groups: control group，model group, medicine group and EA group. The rat model was established under bilateral overiectomy combined with chronic unpredictable stress (CUMS). Medicine group was treated with clomipramine hydrochloride orally and EA group

EA therapy at Bai hui(DU20)，San yin jiao(SP6) and Shen shu(BL23).The behavior was measured by forced swimming test. We detected vaginal pictures, dopamine(DA), serotonin (5-HT) and cysteinyl aspartate specific proteinase-3 (Caspase-3) in the hippocampal by immunoassay (ELISA).Using Nissl's staining method to observe the pathological changes of nerve cells in the dentate gyrus (DG) of hippocampal. Results: Compared with model group, in the forced swimming test immobility time significantly shortened; DA and 5-HT increased,the protein level of Caspase-3 decreased, number of nerve cells, total area, integral optical density(IOD) and average blackness of nissl's body in DG area increased, the difference was statistically significant.Conclusion: Electroacupuncture therapy can reduce the depression symptoms and reverse neurocyte apoptosis in the depression rat model，help to increase hippocampal neuron generation, survival and neogenesis.

Perimenopausal depression; Neurotransmitter; Caspase-3; Niss' l body; Cell apoptosis

国家自然科学基金面上项目(81373718)-基于“肾脑相济”理论探讨电针诱导脑海马内源性神经干细胞分化治疗围绝经期抑郁症的作用；中医“肾精命火”脏象理论相关疾病与证候的研究(2010CB530401973)

荆 秦(1987-)，女，辽宁大连人，讲师，医学硕士，从事针刺机理的现代研究。

△通讯作者：任 路，Tel：024-31207318,E-mail: renlu2008.student@sina.com。

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1006-3250(2017)11-1607-04

2017-03-10