I群禽腺病毒检测方法研究进展

殷国政，段世豪，司振书，李玉保

(聊城大学农学院，山东聊城 252000)

Ⅰ 群禽腺病毒(Fowl adenovirus group I,FAV-I)属于腺病毒科禽腺病毒属，在禽群中分布广泛。Ⅰ群禽腺病毒具有共同的群抗原，其根据分子结构可将血清型分为 A、B、C、D、E 5个种，基于交叉中和试验和限制性内切酶酶切分析，又分为A(血清1型)、B(血清5型)、C(血清4、10型)、D(血清2、3、9、11型)、E(血清6、7、8a、8b型)等12个血清型[1]。其中，鸡腺病毒1型，又名鸡胚致死孤儿病毒(chicken embryo lethal orphan virus,CELO)，引致鹌鹑支气管炎；鸡腺病毒4型，可引起鸡心包积液与包涵体肝炎综合征(hepatitis-hydropericardium syndrome，HHS)；鸡腺病毒8型，可引致鸡包涵体肝炎(inclusion body hepatitis,IBH)。Ⅰ群禽腺病毒通过候鸟水禽等传播于世界各地，难以控制，并且可以与其他病毒混合感染，给养禽业造成严重的经济损失。综述国内外I群禽腺病毒的分离培养、形态学检测、血清学检测及分子生物学检测方法，以促进对该类病毒感染进行及时确诊和有效防控。

1 病毒的分离培养

对该病毒进行分离培养，可采取家禽的肝脏等组织、口腔拭子或泄殖腔拭子，处理后接种鸡胚或细胞。

1.1鸡胚培养禽腺病毒的培养方法主要有鸡胚培养和细胞培养2种，鸡胚培养通过将处理好的病料组织研磨液，接种到9～11日龄SPF鸡胚的卵黄囊、尿囊膜和尿囊腔中，进行增殖培养；邱丽叶等[2]将 FAV分别接种到 SPF鸡胚的卵黄囊、尿囊膜和尿囊腔中，并利用荧光定量 PCR方法测定鸡胚组织中FAV的病毒含量，结果发现不同接种途径对 FAV在肝脏、尿囊膜和尿囊液中的病毒增殖情况影响较大，其中经卵黄囊途径接种的 SPF鸡胚， FAV增殖能力最强。

1.2细胞培养细胞培养是通过将 FAV接种到原代肾细胞或鸡肝癌细胞中，待细胞变性、形态变圆、脱落，当细胞核内出现明显的包涵体等细胞病变时，将细胞液回收备用[3]。 赵莉等[4]用不同浓度的血清培养细胞，并以不同接种比例传代。对最佳感染复数下的细胞病变和病毒增殖情况以及病毒接种浓度与蚀斑形成数量之间的关系进行研究。确定了鸡肝癌细胞的最佳培养条件： 采用10%FBS的培养基，以1∶5比例传代培养；病毒的接种浓度可以直接影响蚀斑形成数量，并且呈线性相关关系，所以鸡肝癌细胞适合腺病毒培养。周斌等[5]分别用鸡胚成纤维细胞和鸡胚肾细胞培养禽腺病毒江苏分离株，发现鸡胚成纤维细胞接种病毒后没有出现病变。鸡胚肾细胞感染病毒后则表现出很强的聚集性，细胞呈团状或束状、脱落等标志性病变。

2 病毒形态学检测

在鸡胚传代培养中选择有明显病变的鸡胚进行取料，研磨，冻融离心(3 000 r/min，20 min)，收取上清液，放置在铜网上用2%磷钨酸负染，再置于透射电镜下观察，观察到球形、无囊膜、呈二十面体对称的典型腺病毒， 直径70～80 nm，可判定为阳性感染[6]； 或取尿囊液，先离心(10 000 r/min，10 min)取上清， 再离心(13 000 r/min，1 h)去上清，留取100 μ L悬浊液，混匀后再使用磷钨酸染色，吸干液体，利用透射电镜观察病毒形态结构是否符合腺病毒的病原特征[7]。

3 血清学检测

3.1病毒中和试验中和试验是一种以测定病毒的感染性为基础的特异性和敏感性都很高的血清学检测方法，在外界环境下，病毒可以和相应的特异性抗体结合，从而失去其感染能力。Calnek等[8]通过对FAV不同血清型毒株进行中和试验研究，根据不同血清型的敏感性不同，建立一种可以准确测定I群禽腺病毒的血清学检测方法。

3.2琼脂凝胶沉淀试验琼脂凝胶沉淀试验(agar gel precipitation， AGPT)在禽腺病毒抗体的检测试验中被广泛应用，这种检测方法成本低，并且非常便捷，但是相较其他检测方法其敏感性较低，通常在琼脂凝胶扩散时，禽腺病毒的抗原和抗体需孵育2～3 d，才会出现沉淀线[9]。AGPT对多种血清型混合感染的商品鸡的腺病毒检测比较敏感，但对SPF鸡群感染的腺病毒的敏感性较低[10]。国纪垒等[11]采用双向琼脂扩散试验，对分离毒株进行血清学鉴定。4株病毒均与阳性血清出现沉淀线。智海东等[12]使用禽腺病毒 Ⅰ型 CELOV 株研制琼脂扩散的标准抗原，通过检测该抗原的效价和特异性，并对试验感染鸡抗体的变化以及现有血清样本进行检测。结果表明，该抗原特异性高，不与其他病毒阳性血清反应，而且可与1∶8稀释的禽腺病毒Ⅰ型阳性血清反应。

3.3酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(enzyme linked immuno sorbent assay，ELISA)技术可以对FAV I抗体进行精确测定，能更确切地反映病毒感染鸡群的情况。ELISA技术原理是先将抗原或抗体置于酶标板上，使其与酶标板底部固定物结合，并保持活性，然后再加入抗体或抗原使其结合，形成抗原抗体复合物，再用酶标记的第二抗原与其结合，形成具有免疫学活性和酶的活性的复合物，加入可以与酶产生带色产物的底物，使其显色。产物的量与颜色呈正相关，因此，可以根据产物的颜色及酶标仪的测定结果对受检样品进行定性或定量分析。Calnek等[8]通过纯化10个不同血清型毒株，制作包被抗原，建立ELISA方法检测禽腺病毒抗体。Dawson等[13]建立能够快速检测出自然感染的FAV-I 抗体及CEL0株抗体的ELISA方法。 Saifuddin等[14]建立可以检测出感染低于100 TCID50/mL的 FAd病毒的组织或血液中抗原的 ELISA方法，文艳玲[15]将 Hexon表达的抗原蛋白作为包被抗原，建立检测 FAV- I抗体的间接 ELISA方法， 其对免疫的 SPF及血清中的抗体敏感性很高。Marek等[16]运用六邻体表达的重组蛋白作为包被抗原，建立了一种检测FAdV的ELISA方法和斑点ELISA方法，该ELISA方法阳性检出率良好。罗思思等[1]用五邻体表达且纯化的重组原核蛋白作为包被抗原，建立了一种快速检测FAV-I抗体的间接ELISA方法。

4 分子生物学检测

4.1聚合酶链式反应聚合酶链式反应(polymerase chain Reaction，PCR)是一种利用PCR 仪扩增特定DNA片段的一种分子生物学技术。谢芝勋[17]建立对3个群的FAVI检测的PCR方法，该方法的敏感性为100 ng；Raue等[18]在保守区利用根据hexon基因的4个变异区设计了特异性引物H1/H2和H3/H4，PCR扩增了FAVI的12个血清型的病毒DNA，均扩出目的片段，但是不能从EDS和HEV的病毒DNA中扩增出任何片段；Xie等[19]建立了对3个群16个不同血清型毒株检测的PCR方法，敏感性是100 ng，并对21个野毒分离株进行检测，利用分子杂交技术来提高检测的敏感性；李天芝等[20]根据 Gen Bank 收录的Ⅰ群禽腺病毒的hexon基因保守序列，设计引物，并建立检测Ⅰ群禽腺病毒PCR方法，然后对它的特异性、敏感性进行研究，对Ⅰ群禽腺病毒检测的灵敏性为1 pg总DNA量。

4.2实时荧光定量PCR实时荧光定量 PCR是在 PCR的反应基础上加入荧光探针或荧光染料，利用产生的荧光信号实时监测整个 PCR扩增过程，最后通过建立的标准曲线对监测模板进行定量或定性分析的分子生物学技术。文艳玲等[21]利用的I群禽腺病毒的hexon基因保守序列设计了引物，并根据不同血清型毒株的保守序列不同建立检测 I群禽腺病毒12个血清型的 SYBR Green I荧光 PCR方法；Marek等[16]为了对一株I群禽腺病毒进行鉴定分析，利用系统进化分析法和hexon基因L1区的高通量溶解曲线成功鉴定了这株腺病毒；Steer等[22]根据I群禽腺病毒的12个血清型的hexon基因进行高通量溶解曲线成功对不同血清型腺病毒进行鉴定。

4.3限制性片段长度多态性聚合酶链反应技术限制性片段长度多态性聚合酶链反应(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)技术，其基本原理是用设计的特异性 PCR引物扩增出目的基因，再利用不同等位基因的酶切位点分布不同，用限制性内切酶将扩增的 PCR 片段切割成大小不同的多个片段，再用琼脂糖凝胶电泳进行观察。I群禽腺病毒有12个血清型，各血清型的基因组酶切位点不同，因此可利用此方法对其进行区分。Meulemans等[23]设计的hexonA/hexonB引物，利用PCR扩增出了12个血清型参考毒株的对应片段，并结合限制性内切核酸酶分析26株分离株的血清型；李海英等[24]利用3对基于Hexon全基因序列设计合成的引物分别对I群禽腺病毒的12种血清型毒株进行PCR扩增，通过限制性内切酶 Hae II 对扩增产物进行酶切，并进行序列测定和PCR-RFLP 分析，最后通过琼脂糖凝胶电泳成功区分出12个不同的血清型。唐熠等[25]设计合成了一对根据I群禽腺病毒的 Hexon 保守基因序列的引物,通过对12种血清型的Hexon基因进行PCR扩增，并使用酶切技术可以对I群禽腺病毒的12个血清型进行分型。

4.4环介导等温核酸扩增技术环介导等温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，是日本学者Notomi在2000年发明的一项恒温核酸扩增新技术，该方法可通过肉眼(能否观察到白色混浊沉淀判定)或在紫外线下(产物中加入SYBR Green I染料)判定结果。该检测方法仅需一个水浴锅即可完成反应，简单快速，适合在现场与基层部门应用。唐熠等[26]根据I群禽腺病毒hexon基因保守区序列设计了一对特异性环介导等温扩增引物，并建立一种敏感性可达101copies/pL适用于I群禽腺病毒的LAMP快速检测方法。通过对建立的LAMP方法与常规PCR方法进行效果对比，检出率分别为58.3%和37.5%。表明其建立的LAMP方法更加简捷、灵敏、特异性高，适用于I群禽腺病毒感染的快速诊断。

4.5核酸探针技术核酸探针技术是根据碱基的互补配对的原则，用已知的带有标记核酸序列与被检测的目的序列互补结合，通过监测标记信号来检测目的基因。该方法特异性强，重复性高。董婷婷[27]制备了地高辛标记的I 群禽腺病毒血清 1、2、4、8和 12 型的核酸探针，而且之间无交叉反应，并应用于临床样本检测。检测结果发现，临床上血清2型、4型和8型较为多发。朱后顺[28]利用地高辛作为标记物，制备I群禽腺病毒核酸探针，临床样本进行检测发现该探针能检测出最低1pg的病毒，敏感性很高。王凤龙等[29]用限制酶HindⅢ和EcoRI 对鸡包涵体肝炎六邻体蛋白基因片段重组质粒进行双酶切，得到636 bp基因片段的重组质粒，用地高辛标记制备了鸡包涵体肝炎病毒 DNA 探针。试验表明该探针对该腺病毒具有良好的灵敏度和特异性，可用于鸡包含体肝炎病毒的分子病理学研究和特异性诊断。

5 结语

近几年，由I群禽腺病毒引起的鸡包涵体肝炎及心包积液综合征对我国养禽业造成很大危害，涉及山东、河南、河北、江苏、湖北、海南、广西等多个省市，不同品种、日龄的鸡群均有报道。I群禽腺病毒有些毒株易与鸡传染性法氏囊病毒、传染性贫血病毒及H9亚型禽流感病毒混合感染，危害严重。目前，在禽腺病毒的流行病学和诊断方面的研究虽已取得较大进展，但在研发特异性高、敏感性强的快速诊断方法以及高效疫苗等重要领域还需更加深入地研究。