过敏性休克猝死者IgE、IL-4、IL-13在组织中的表达及法医学意义

王玉丹，张忠庆，亓开元，崔光来，丁宪国，刘 勇

(1.遵义医学院 法医学院法医病理学教研室，贵州 遵义 563099 2.遵义医学院 法医学院2014级，贵州 遵义 563099)

临床医学研究

过敏性休克猝死者IgE、IL-4、IL-13在组织中的表达及法医学意义

王玉丹1，张忠庆1，亓开元2，崔光来2，丁宪国2，刘 勇1

(1.遵义医学院 法医学院法医病理学教研室，贵州 遵义 563099 2.遵义医学院 法医学院2014级，贵州 遵义 563099)

目的观察过敏性休克猝死者组织中IgE、IL-4、IL-13的表达，探讨其在法医学中的作用。方法过敏性休克猝死组为遵义医学院附属医院司法医学鉴定中心2010～2016年临床高度怀疑，经尸检明确诊断为过敏性休克猝死病例15例，对照组为机械性损伤死亡病例20例。取两组病例的肺、气管、喉、脾、肠组织块经福尔马林固定，HE染色观察组织的病理学变化，免疫组化(Immunohistochemistry，IHC)法检测组织中IgE、IL-4、IL-13的表达水平。结果与对照组比较，过敏性休克猝死组见较多嗜酸性粒细胞浸润伴不同程度水肿，组织中IgE、IL-4、IL-13的表达明显增强。结论过敏性休克猝死者组织中IgE、IL-4、IL-13在肺、气管、喉、脾、肠中的表达增强，提示其参与了过敏性休克的发生，可作为鉴定过敏性休克猝死的实验室诊断参考辅助指标之一。

过敏性休克；白细胞介素4；白细胞介素13；免疫球蛋白E；猝死

在法医鉴定中过敏性休克死亡病例常见，但过敏反应发生在死亡前还是死亡后的诊断依据目前尚未解决，且致病因素和病理生理学过程的复杂性，法医诊断往往得不到肯定的结论，在常规案件中过敏性死亡的死后诊断仍然基于排除其他诊断和间接证据诊断。血清总免疫球蛋白E(Immunoglobulin E，IgE)、肥大细胞类胰蛋白酶目前被作为过敏性休克诊断的实验室参考指标，但肥大细胞类胰蛋白酶正常参考值范围国际还未统一，并且在各组织的分布及含量不明确。而IgE的血清含量与死后凝血、溶血、年龄、某些IgE寄生虫病、遗传性过敏症患者有关，单一检测IgE并不能客观反映死者死因[1]。故死者体内IgE含量升高或正常并不能说明死者生前是否发生过敏反应，应联合其他指标共同检测判断。目前已知的IgE调节因子IL-4( Interleukin-4，IL-4)和IL-13( Interleukin -13，IL-13)，在非IgE介导及IgE介导的过敏反应中表达均增加，在过敏反应中起重要作用[2]。前期在豚鼠过敏性休克模型中用ELISA法检测到过敏性休克组豚鼠血清中IgE、IL-4和IL-13含量较对照组均明显升高，结果具有统计学差异[3]。本实验通过回顾研究15例临床高度怀疑且经尸检明确诊断为过敏性休克猝死病例，采用IHC法检测死者肺、气管、喉、脾、肠组织中IgE、IL-4、IL-13的表达情况，以探讨IgE、IL-4、IL-13在法医学诊断过敏性休克中的作用。

1 材料与方法

1.1材料 临床高度怀疑且经尸检明确诊断为过敏性休克猝死病例15例及机械性损伤死亡病例20例均来自遵义医学院附属医院司法医学鉴定中心2010～2016年的病例，其中过敏性休克猝死组在尸检时抽血检测其IgE血清含量，均经过系统的尸体检验(死后6～72 h)，尸检时脏器组织固定于10%中性福尔马林缓冲液中。

1.2 主要试剂与仪器 Rabbit Anti-IgE[RM122](ab195 580)、Rabbit Anti-IL-4(ab9 622)、Rabbit Anti-IL-13(ab106 732)、MaxvisonTMHRP(Mouse/Rabbit)IHC Kit(KIT-5 020)、UltraDAB显色试剂盒(DAB-4 032)均购于Abcam有限公司。组织包埋仪(德国LEICA公司)、石蜡切片机(德国LEICA公司)、光学显微镜(日本OLYMPUS公司)、图像采集系统(日本OLYMPUS公司)。

1.3 方法 各组经10%甲醛固定后的肺、气管、喉、脾、肠，取材修剪、冲洗、酒精脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋、切片。

1.3.1 HE染色 切片烘烤、脱蜡、染色、封片、镜检。

1.3.2 免疫组化 二步法，切片常规脱蜡至水，高压锅热修复法修复抗原，一抗4 ℃过夜( Rabbit Anti-IgE、Rabbit Anti-IL-4、Rabbit Anti-IL-13，抗体浓度均为1:150)，按照免疫组织化学染色试剂盒(abcam公司)说明书进行操作。阴性对照以PBS代替一抗。

1.3.3 结果判定 镜下观察IgE主要定位于细胞质内，呈棕黄色颗粒，位于嗜酸性粒细胞、肥大细胞、组织细胞、淋巴滤泡、肺泡上皮细胞，血管壁及其周围组织间隙亦出现浅黄色或棕黄色颗粒；IL-4、IL-13主要定位于细胞质内，呈棕黄色颗粒，位于嗜酸性粒细胞、组织细胞、巨噬细胞、肺上皮细胞，小血管及结缔组织出现浅黄色或棕黄色区域。用IPPWIN32软件进行分析，计算OD(平均光密度值)=IOD(积分光密度值)/Area(面积)。

2 结果

2.1 15例过敏性休克猝死病例血清IgE含量 、过敏原因及致敏后死亡时间(见表1)。

2.2 HE染色 对照组镜下各组织见极少量或无嗜酸性粒细胞浸润，组织无明显水肿。过敏性休克猝死组肺淤血水肿，支气管、喉、气管粘膜层充血水肿；肺泡壁及间质内、支气管、喉、气管、肠粘膜层及脾髓索髓窦内见大量嗜酸性粒细胞浸润(见图1)。

2.3 组织中IgE的表达 对照组肺泡上皮细胞胞质、肺泡隔及喉个别组织细胞、肠粘膜下呈少量棕黄色颗粒表达，脾、气管阴性表达。过敏性休克猝死组中2例(198 U/mL、179 U/mL)弱阳性表达，13例(血清IgE均大于333 U/mL)各组织呈阳性或强阳性表达：肺内嗜酸性粒细胞、组织细胞、肺泡上皮细胞胞质及肺泡隔、血管周围、支气管周围呈棕褐色颗粒强阳性表达；喉嗜酸性粒细胞及组织细胞胞质内阳性表达；脾淋巴滤泡、嗜酸性粒细胞胞质阳性表达；肠组织细胞胞质、粘膜固有层阳性表达(见图2)，其中1例(婴儿)肠组织中表达强阳性。用IPPWIN32软件进行分析，过敏性休克猝死组与对照组比较肺、气管、喉、脾、肠IgE表达明显增强，差异有统计学意义(P<0.05,见表2)。

表1 15例过敏性休克猝死病例尸体血清中IgE含量

序号性别年龄(岁)过敏原因致敏后死亡时间(min)IgE含量(U/mL)1男44青霉素 101270．02男1 头孢派酮30410．53男8个月奶粉 60520．14男63头孢克洛40198．05女25头孢他啶30430．66男40青霉素 30179．07男35头孢克肟51120．48女49头孢派酮51230．59男50青霉素 101450．310男38头孢克肟30987．511女44头孢替安40656．512男43青霉素 5894．513男32 头孢呋辛酯60945．714男28头孢地尼101020．715男56青霉素 30905．5

成人血清IgE水平约在20～200 U/mL，一般认为大于333 U/mL(800 ng/mL)时为异常升高。婴儿脐带血IgE水平小于0.5 U/mL，出生后随年龄增长而逐渐升高，12岁达成人水平。

A-E:分别为过敏性休克猝死组肺、气管、喉、脾、肠HE染色，各组织见较多嗜酸性粒细胞浸润;F-J:分别为对照组肺、气管、喉、脾、肠HE染色，各组织极少量或无嗜酸性粒细胞浸润。图1 肺、气管、脾、肠组织嗜酸性粒细胞浸润情况(HE×400)

A-E：过敏性休克猝死组肺、气管、喉、脾、肠IgE免疫组化染色结果;F-J：对照组肺、气管、喉、脾、肠IgE免疫组化染色结果。图2 肺、气管、喉、脾、肠IgE表达(IHC二步法×400)

表2各组织IgE平均光密度

组别例数IgE平均光密度(x±s)肺气管喉脾肠实验150．42±0．03∗0．28±0．03∗0．38±0．02∗0．28±0．01∗0．24±0．04∗对照200．23±0．010±0 0．11±0．010±0 0．11±0．02

*表示与对照组比较，P<0.05。

2.4 组织中IL-4的表达 对照组肺、气管、脾表达较多，其中脾组织在脾髓索髓窦内表达，余组织内少量表达。过敏性休克猝死组在脾髓索、髓窦内嗜酸性粒细胞、肥大细胞、巨噬细胞、组织细胞胞质棕褐色颗粒表达较多，淋巴滤泡内无表达；肺嗜酸性粒细胞、肥大细胞、组织细胞、肺上皮细胞胞质、肺泡隔及血管周围、支气管周围呈棕褐色颗粒表达较多；喉淋巴组织内棕褐色颗粒表达；肠淋巴组织、粘膜层、嗜酸性粒细胞胞质棕褐色颗粒表达(见图3)。用IPPWIN32软件进行分析，过敏性休克猝死组与对照组比较肺、气管、喉、脾、肠IL-4表达明显增强，差异有统计学意义(P<0.05,见表3)。

A-E：过敏性休克猝死组肺、气管、喉、脾、肠IL-4免疫组化结果，均呈强阳性表达;F-J：对照组IL-4免疫组化结果，肺、气管、脾阳性表达，喉、肠为弱阳性。图3 肺、气管、喉、脾、肠IL-4表达(IHC二步法×400)

表3各组织IL-4平均光密度

组别例数IL-4平均光密度(x±s)肺气管喉脾肠实验150．52±0．06∗0．33±0．02∗0．34±0．03∗0．41±0．02∗0．26±0．03∗对照200．21±0．010．22±0．030．17±0．010．23±0．020．14±0．01

*表示与对照组比较，P<0.05。

2.5 组织中IL-13的表达 对照组肺、脾表达较多，脾脏在髓索、髓质内少量棕黄色颗粒表达，余组织内少量表达。过敏性休克猝死组在肺泡嗜酸性粒细胞、肥大细胞、组织细胞、上皮细胞胞质及肺泡隔及血管、支气管周围呈棕褐色颗粒强阳性表达；喉嗜酸性粒细胞、肥大细胞、组织细胞胞质内棕褐色颗粒强阳性表达；脾髓索、髓窦内嗜酸性粒细胞、肥大细胞、组织细胞、巨噬细胞胞质棕褐色颗粒强阳性，淋巴滤泡无表达；肠淋巴组织细胞胞质、粘膜固有层、嗜酸性粒细胞强阳性表达(见图4)。用IPPWIN32软件进行分析，过敏性休克猝死组与对照组比较肺、气管、喉、脾、肠IL-4表达明显增强，差异有统计学意义(P<0.05，见表4)。

表4各组织IL-13平均光密度

组别例数IL-13平均光密度(x±s)肺气管喉脾肠实验150．44±0．04∗0．35±0．02∗0．37±0．01∗0．43±0．02∗0．27±0．02∗对照200．21±0．030．12±0．010．18±0．020．26±0．020．11±0．02

*表示与对照组比较，P<0.05。

A-E:过敏性休克猝死组肺、气管、喉、脾、肠IL-13免疫组化结果，均为强阳性表达; F-J:对照组IL-13免疫组化结果，肺、脾为阳性表达，气管、喉、肠为弱阳性。图4 肺、气管、喉、脾、肠IL-13表达(IHC二步法×400)

3 讨论

过敏反应是一种Ⅰ型超敏反应，症状可从轻微到严重，甚至在短短几分钟内致人死亡，本病例中注射药物后最快5 min内出现死亡。过敏反应通常是由IgE介导的，其诊断价值已被认可。过敏原首次进入机体可诱导特异性B细胞产生抗体IgE，通过Fc片断选择性附着在皮肤、呼吸道或消化道黏膜以及血液中的某些细胞，当抗原再次进入时FCεRI发生桥联使受体细胞激活释放多种生物活性介质，以血管扩张和血管渗漏为特征，导致持续性低血压及心输出量减少，出现休克症状。本实验HE染色见嗜酸性粒细胞在各组织中表达增加，以喉、肺、脾表达更多，与Edston[4]研究发现的过敏性死者肺、脾组织中嗜酸性粒细胞增加相似。过敏性休克猝死组中14例死于药物过敏，特别是抗生素类药物，1例(婴儿)死于奶粉过敏。尸检时检测血清IgE，13例均大于333 U/mL ，2例在正常范围(198 U/mL、179 U/mL)，尸检并未发现其他严重致死性疾病，根据其过敏原接触史及临床表现诊断为过敏性休克猝死。过敏性休克猝死组中血清IgE含量均升高的13例免疫组化显示肺、气管、喉、脾、肠均呈阳性至强阳性表达，且大多在肺、气管、喉、脾(淋巴滤泡)、肠组织细胞、嗜酸性粒细胞胞质内，从统计结果中提示肺组织是反应最强的器官。与谢洪波[5]检测豚鼠过敏性休克死后肺、气管、脾、肠组织IgE呈阳性表达结果相似。其中1例(婴儿)奶粉过敏死亡的肠组织中IgE表达最强，提示食物过敏时胃肠组织可能是反应最强烈的器官。过敏性休克猝死组中2例(IgE浓度198 U/mL、179 U/mL)IgE弱阳性表达，提示某些过敏反应可能不是通过激活IgE发生，可能是某些抗生素、药物直接促进体内肥大细胞脱颗粒或嗜酸性粒细胞释放炎性介质，发生所谓的过敏样免疫反应，此时死者体内IgE并不升高，或是受死后各种因素影响，如死后尸体未在短时间内冷冻保存[6]、死后组织自溶等。故单纯检测血清或组织IgE表达在法医学鉴定中也只能作为辅助参考指标，应联合其他指标共同诊断。

IL-4在1982年被Howard发现并命名为B细胞生长因子-1(B cell growth factor-1，BCGF-1)，因其在T细胞培养上清液中能促进B细胞的增殖。IL-4是Ⅱ型辅助T细胞分泌的细胞因子，嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、NK细胞也能分泌。本实验过敏性休克猝死组中IL-4主要位于肺嗜酸性粒细胞、组织细胞、肺上皮细胞胞质，喉及脾髓索、髓窦内嗜酸性粒细胞、组织细胞胞质，肠淋巴组织、粘膜层、嗜酸性粒细胞胞质，且各组织强阳性表达。过敏性休克猝死组IL-4不仅在上述细胞内高表达，其分泌颗粒在组织中也被检测到，提示IL-4参与了过敏性休克的发生。本实验IL-4多表达在嗜酸性粒细胞胞质中，与Gessner[7]等通过小鼠模型发现IL-4在嗜碱性粒细胞中激活后产生表达不一致，提示在动物和人体内过敏性反应发生时IL-4产生机制可能有差别，或基于对嗜碱性粒细胞检测的难度。

研究发现在缺乏IL-4基因，表达IL-13的转基因小鼠淋巴组织中IL-13能诱导IgE产生[8]。故IL-4不是使类别抗体转向IgE的唯一途径，提示IL-13也起着重要作用。IL-13是一种由CD4+Th2细胞分泌的多效性细胞因子，也能诱导人类B细胞类抗体转向IgE，对IgE有上调作用。IL-13与IL-4的基因序列上有四分之一的同源性，两者在功能上重叠，被认为是IgE类转换与过敏性疾病发展的核心。IgE激活的肥大细胞表达IL-13mRNA，持续时间长达72h[9]。IL-13可刺激和活化B细胞生长，诱导IgE合成，在B细胞产生IgE过程中IL-13是除IL-4以外的另一个重要的B细胞刺激因子[10]。本实验过敏性休克猝死组中IL-13主要在各组织嗜酸性粒细胞及组织细胞胞质中表达，IL-13不仅在上述细胞内高表达，其分泌颗粒在组织中也被检测到，故IL-13和IL-4一样参与了过敏性反应的发生。

综上所述，本实验过敏性休克猝死组均表达IL-4、IL-13，且与对照组比较有明显统计学差异，过敏性休克猝死组肺、气管、喉、脾呈强阳性表达，肠呈阳性表达，大多表达在嗜酸性粒细胞、肥大细胞、组织细胞、巨噬细胞内，少量在细胞外组织内被检测到，分析上述细胞在过敏反应时分泌进入组织发挥作用，提示IL-4、IL-13与IgE一样参与了过敏性休克发生，证实它们在组织中的高表达。结果与豚鼠过敏性休克模型研究中IgE、IL-4、IL-13在血清中含量升高一样[3]，也与McGwire等[11]报道过敏性疾病中肺、气管、脾、肠中均表达IL-4、IL-13一致。IgE在脾中的表达位置与IL-4、IL-13不同，IgE主要表达在脾滤泡中心淋巴组织内，而IL-4、IL-13主要表达在脾髓索髓窦内，与其产生细胞分布相符合。Gaspard等[12]报道青霉素过敏者中特异性IgE抗体阳性与IL-4、IL-13和IFN-r升高及IL-10降低有关，IL-4与IL-13在血清中水平存在正相关。实验数据统计提示本实验过敏性休克猝死组IL-4、IL-13在各组织中的表达均强于IgE，提示在过敏性反应中发挥重要作用，但本实验IL-13的表达与IL-4的表达差异不明显，仍需进一步研究。且IL-4、IL-13在正常组织内表达较多，提示其除参与过敏反应外，可能还参与其他的发病机制。总之，在IgE和非IgE介导的过敏性反应中，IL-4和IL-13都参与其发生，联合检测IgE、IL-4、IL-13有望作为过敏性休克猝死的诊断参考辅助指标之一。

[1] Cecchi R.Diagnosis of anaphylactic death in forensics:Review and future perspectives [J].Leg Med,2016,22:75-81.

[2] Osawa M,Satoh F,Horiuchi H,et al.Postmortem diagnosis of fatal anaphylaxis during intravenous administration of therapeutic and diagnostic agents:evaluation of clinical laboratory parameters and immunohistochemistry in three cases [J].Leg Med (Tokyo),2008,10(3):143-147.

[3] 刘勇,陈小倩,李航,等.豚鼠过敏性休克死亡白细胞介素-4、白细胞介素-13与免疫球蛋白E的表达及法医学意义 [J].重庆医科大学学报,2013,38(11):1322-1324.

[4] Edston E.Accumulation of eosinophils,mast cells,and basophils in the spleen in anaphylactic deaths [J].Forensic Sci Med Pathol,2013,9(4):496-500.

[5] 谢洪波.IgE、P物质在过敏性休克死亡豚鼠脏器中的表达及法医学意义 [D].南昌：南昌大学,2016.

[6] 苏俊,余舰,刘勇.过敏性猝死豚鼠不及时冷藏对血清IgE的影响及法医学意义 [J].法医学杂志,2015,31(5):341-342.

[7] Mcleod J J,Baker B,Ryan J J.Mast cell production and response to IL-4 and IL-13 [J].Cytokine,2015,75(1):57-61.

[8] Junttila I S,Mizukami K,Dickensheets H,et al.Tuning sensitivity to IL-4 and IL-13:differential expression of IL-4Ralpha,IL-13Ralpha1,and gammac regulates relative cytokine sensitivity [J].J Exp Med,2008,205(11):2595-2608.

[9] Takeuchi M,Ohno K,Takata K,et al.Interleukin 13-positive mast cells are increased in immunoglobulin G4-related sialadenitis [J].Sci Rep,2015,5：7696.

[10]Takada E,Furuhata M,Nakae S,et al.Requirement of apoptosis-inducing kinase 1 for the induction of bronchial asthma following stimulation with ovalbumin [J].Int Arch Allergy Immunol,2013,162(2):104-114.

[11]Agrawal S,Townley R G.Role of periostin,FENO,IL-13,lebrikzumab,other IL-13 antagonist and dual IL-4/IL-13 antagonist in asthma [J].Expert Opin Biol Ther,2014,14(2):165-181.

[12]Gaspard I,Guinnepain M T,Laurent J,et al.IL-4 and IFN-gamma mRNA induction in human peripheral lymphocytes specific for beta-lactam antibiotics in immediate or delayed hypersensitivity reactions [J].J Clin Immunol,2000,20(2):107-116.

[收稿2017-08-04;修回2017-10-19]

(编辑：王福军)

TheexpressionandsignificanceofIgE、IL-4andIL-13fromtissueofsuddendeathbyanaphylacticshockinforensicmedicine

WangYudan1，ZhangZhongqing1，QiKaiyuan2，CuiGuanglai2，DingXianguo2，LiuYong1

(1.Department of Forensic Pathology， Forensic Medicine College，Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099，China；2.Grade 2014，Forensic Medicine College，Zunyi Medical University，Zunyi Guizhou 563099，China)

ObjectiveThe expression on IgE,IL-4 and IL-13 from the tissues of sudden death of anaphylactic shock was examined to detect its role in forensic diagnosis of anaphylactic shock.MethodsThe sudden death from anaphylactic shock were highly under clinical suspicion and clearly confirmed by forensic diagnosis.The number of these specimens is 15,and was obtained from Zunyi Medical University SFJDZX during 2010 to 2016.The control group was 20 cases,died from mechanical injury.Tissues of lung,trachea,larynx,spleen and intestine were fixed with formalin and stained with HE；The pathological changes were observed,and the expressions levels of IgE,IL-4 and IL-13 were detected by immunohistochemistry.ResultsThe phenomenon of more eosinophils infiltration with edema in the various degrees,and increasing levels of IgE,IL-4 and IL-13 in experimental group were found,compared with the control group.ConclusionThe expression of IL-4,IL-13 and IgE in sudden death tissues of anaphylactic shock was increased,which is involved in the occurrence of anaphylactic shock,and can be used as one of the reference indexes for the identification of sudden pathological changes of anaphylactic shock sudden death.

anaphylactic shock;Interleukin-4;Interleukin -13;Immunoglobulin E;sudden death

贵州省科学技术基金资助项目(NO:黔科合J字2012-2362)。

刘勇，男，副教授，研究方向：法医病理学，E-mail:517243273@qq.com。

D919.4

A

1000-2715(2017)06-0650-06