苏黄止咳胶囊对咳嗽变异性哮喘豚鼠的干预作用研究

高明 张忠德 李际强 李洪涛

摘要 目的：观察苏黄止咳胶囊对咳嗽变异性哮喘（Cough Variant Asthma，CVA）豚鼠模型的影响。方法：将55只豚鼠随机分成正常对照组、模型对照组、醋酸泼尼松组及苏黄止咳胶囊高、低剂量组，结合文献方法制作CVA豚鼠模型，检测各组豚鼠咳嗽次数、支气管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar Lavage Fluid，BALF）中嗜酸粒细胞百分率及气道阻力变化。结果：与正常对照组比较，模型对照组豚鼠咳嗽次数、BALF中嗜酸性粒细胞百分率明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型对照组比较，苏黄止咳胶囊高、低剂量组豚鼠咳嗽次数明显降低，差异有统计学意义（P<0.05），苏黄止咳胶囊高剂量组豚鼠的气道阻力在乙酰甲胆碱浓度为0.2 mg/mL、0.4 mg/mL时下降明显，差异有统计学意义（P<0.05），苏黄止咳胶囊高剂量组豚鼠BALF中嗜酸性粒细胞百分率下降明显，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：苏黄止咳胶囊对CVA豚鼠的咳嗽次数、BALF中嗜酸性粒细胞百分率及气道阻力有改善作用。

关键词 咳嗽变异性哮喘；苏黄止咳胶囊；豚鼠；气道阻力

Abstract Objective：To observe the effects of Suhuang Zhike capsule on guinea pig model of cough variant asthma. Methods：Fifty-five female guinea pigs were randomly divided into normal control group， model control group， prednisone acetate tablets group and Suhuang Zhike capsule high and low dose group. Based on related literature， set up the guinea pig model of cough variant asthma. Then observe the changes of the cough frequency， the percentage of eosinophils in bronchoalveolar lavage fluid （BALF） and resistance （detection of resistance used the BUXCO RC system）. Results：Compared with the normal control group， the cough frequency and the percentage of eosinophils in BALF of the model control group was significantly increased （P<0.05）； Compared with the model control group， the cough frequency in guinea pig of Suhuang Zhike capsules high and low doses group was reduced obviously （P<0.05）， and the resistance in guinea pigs of Suhuang Zhike capsules high dose group was decreased （P<0.05） when methacholine concentration is 0.2 mg/mL， 0.4 mg/mL， the percentage of eosinophils in BALF of Suhuang Zhike capsules high dose group was decreased obviously （P<0.05）. Conclusion：Suhuang Zhike capsules could ameliorate cough frequency， percentage by eosinophils in BALF and resistance in CVA guinea pig.

Key Words Cough variant asthma； Suhuang Zhike capsules； Guinea pig； Resistance

中图分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2017.02.036

CVA在临床上是一种常见的特殊类型的哮喘。名老中医晁恩祥教授所研制的苏黄止咳胶囊临床应用于CVA患者，对患者咳嗽、咽痒、气急等症状有显著疗效[1]。本实验从咳嗽敏感性、肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞的百分率及气道阻力的变化，探讨苏黄止咳胶囊治疗CVA豚鼠模型可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 55只雌性普通级豚鼠，体质量（300±50）g，由南方医科大学实验动物中心提供（合格证号：44002100005781）。

1.1.2 药物 鸡清白蛋白（OVA）溶液（购自GBCBIO Technologies公司）：将1 g鸡清白蛋白干粉溶于25 mL的生理盐水中先配置成4%OVA溶液，并用生理盐水稀释2%OVA溶液。氢氧化铝干粉（购自天津惠瑞化工科技有限公司，生产编号：20141111）。辣椒素溶液：取辣椒素（购自SIGMA公司）30.5 mg，依次加入吐溫-80 ℃溶液及无水乙醇各1 mL溶解，再加入生理盐水8.0 mL，配成10-2 μmol/L的辣椒素原液，取1 mL的辣椒素原液，稀释至100 mL，成10-4μmol/L溶液。乙酰甲胆碱溶液（乙酰甲胆碱购自SIGMA公司），0.8 mg乙酰甲胆碱溶于1 mL的生理盐水中，对倍稀释成0.4 mg/mL和0.2 mg/mL的溶液。

1.1.3 试剂 苏黄止咳胶囊由扬子江药业集团有限公司生产，批号为15051811，成人用量3粒/次、1次/d、0.45 g/粒。

1.2 方法

1.2.1 熏烟箱与用法 熏烟箱为定制的长、宽、高分别为100 cm×60 cm×60 cm的不锈钢箱体。本实验所用香烟为“红梅”过滤嘴香烟（红塔烟草有限责任公司；烤烟型香烟-焦油量10 mg，烟气烟碱量0.7 mg，烟气一氧化碳量12 mg）。每次在熏烟箱中点燃10根香烟，将香烟点燃后，通过300 mL注射器和三通管的人工操作将烟雾排入熏烟箱，直至香烟燃完。

1.2.2 模型制备与分组 实验动物随机分为正常对照组、模型对照组、苏黄止咳胶囊高、低剂量组、醋酸泼尼松组。除正常对照外的动物在第1～28 d，熏烟0.5 h/d；第15天每只豚鼠注射2% OVA 1 mL和200 mg氢氧化铝的混悬液，第22天每只豚鼠注射2% OVA 1 mL和200 mg氢氧化铝的混悬液加强致敏1次，第29天用1% OVA雾化攻击，连续7次，1次/d[2-4]。正常对照组给予同样剂量的生理盐水。所有动物饲养在普通环境，12 h/12 h光照循环，自由饮水和食用颗粒饲料。

1.2.3 给药方法 在第29天雾化攻击当天开始给药，苏黄止咳胶囊配置成高剂量组为6 g/kg，低剂量为2 g/kg，醋酸泼尼松组为3 mg/kg。灌胃给予相应的药物，1次/d，连续7 d。正常对照组和模型对照组给予同样剂量的生理盐水。

1.2.4 检测指标与方法

1.2.4.1 咳嗽敏感性的测定（CRS） 通过辣椒素咳嗽激发试验判断气道的咳嗽敏感性。采用全身体积描记法（Buxco Electronics WBP System）：1%OVA最后一次雾化攻击后的第2天，将豚鼠放入体描箱内，用10-4 μmol/L辣椒素溶液雾化2 min后观察并记录豚鼠5 min的咳嗽次数。

1.2.4.2 气道高反应性测定 CRS测定24 h以后，有创方法通过RC系统（Buxco Electronics RC System），观察豚鼠气道阻力（RI）的变化。测定基值后，测定30 μL生理盐水及倍增浓度的乙酰甲胆碱（MeCh）激发雾化后RI的变化，MeCh的激发浓度由低到高，依次为0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.8 mg/mL每次雾化1.5 min，观察5 min，并自动记录下每个浓度级别下的气道阻力值（RI）。

1.2.4.3 支气管肺泡灌洗液的收集和支气管肺泡灌洗液中白细胞计数分类 待激发试验完成后，支气管肺泡灌洗3次，2 mL/次PBS，并回收支气管肺泡灌洗液（BALF）。将收集的BALF取200 μL并以3 000 r/min离心10 min，转移上清液，加入红细胞裂解液后，3 000 r/min离心10 min，转移上清液，加入等量PBS涂片，苏木素-伊红染色，在显微镜下进行嗜酸性粒细胞计数，在显微镜下计连续视野中每200个细胞中嗜酸性粒细胞的数量，并计算出嗜酸性细胞的百分率。将收集的BALF取100 μL，以3 000 r/min离心10 min，转移上清液，加入红细胞裂解液后，再以3 000 r/min离心10 min，加入等量PBS，取10 μL进行细胞计数。其余BALF离心后取上清，-80 ℃保存备用。

1.3 统计学方法 上述数据采用SPSS 17.0统计分析软件进行计算，数据以（±s）表示，采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组豚鼠CRS测定[5-7] 与正常對照组比较，模型对照组咳嗽次数明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）；治疗组的咳嗽次数明显低于模型组，苏黄止咳胶囊高、低剂量组的咳嗽次数与模型对照组比较显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）；3个治疗组之间比较，说明苏黄止咳胶囊能抑制动物的咳嗽反应，但差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.2 各组豚鼠的气道高反应测定结果 各组动物在生理盐水激发前的基值和生理盐水激发后的气道阻力（RI，cmH2O*secs/mL）值，差异无统计学意义（P>0.05），但苏黄止咳胶囊高剂量组与模型对照组比较在生理盐水激发时差异有统计学意义（P<0.05）。乙酰甲胆碱激发后，气道阻力值变化比较明显，造模的组较正常组气道阻力上升明显，在乙酰甲胆碱浓度为0.2 mg/mL时，正常组和苏黄止咳胶囊高、低剂量组与模型对照组比较差异有统计学意义（P<0.05），苏黄止咳胶囊低剂量组和激素组与高剂量组比较差异有统计学意义（P<0.05）；在乙酰甲胆碱浓度为0.4 mg/mL时，正常组和苏黄止咳胶囊高剂量组与模型对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）；在乙酰甲胆碱浓度为0.8 mg/mL时模型组的阻力值较前一个激发浓度有所下降，苏黄止咳胶囊低剂量组和激素组与苏黄止咳胶囊高剂量组比较差异有统计学意义（P<0.05）。见表2、图1。

2.3 支气管肺泡灌洗液中白细胞计数及嗜酸性粒细胞百分率的测定结果 与正常组比较，模型对照组的嗜酸性粒细胞百分率及细胞总数明显上升（P<0.05）；与模型对照组比较，治疗组的嗜酸性粒细胞百分率及细胞总数有所下降，高剂量组明显减少（P<0.05）；激素组的嗜酸性粒细胞的百分率稍有上升；3个治疗组之间比较，苏黄止咳胶囊高剂量组的嗜酸性粒细胞百分率较激素组显著下降明显，差异有统计学意义（P<0.05），细胞总数较激素组和低剂量组显著下降，差异有统计学意义（P<0.05）。

3 讨论

CVA主要临床表现为阵发性、刺激性的干咳，且夜间为重，无明显胸闷气喘等症状，具有气道的高反应性。在感冒、遇冷热刺激、灰尘、异味、等多种因素作用下可诱发咳嗽，临床中使用抗生素治疗的效果不佳。中医对此早有记载，将该病归为“咳嗽”“风咳”等病证范畴，《医门法律》曰：“风、火、热、湿、燥及寒，皆能乘肺，皆足致咳”。《诸病源候论》记载：“有十种咳、一曰风咳，欲语因咳言不得是也”，因此“风咳”居于首位，虽属哮喘，但以咳为主，即名曰“风咳”。晁恩祥教授提出风邪独立致咳的观点，以“风咳”立论[8]，研制了苏黄止咳胶囊，其方以麻黄为君，宣肺止咳平喘；紫菀、五味子等为臣，敛肺止咳化痰，疏缓气道；佐以苏子、前胡等，配合麻黄宣降相协；配蝉蜕等使药加强疏散风邪，并能利咽止痒。

本实验采用有创的方法观察乙酰甲胆碱激发试验检测豚鼠的气道阻力（RI）[7]。RC系统是Buxco检测动物气道阻力与动态肺顺应性的系列有创系统中的新产品，检测时需要对动物进行麻醉，并实施气管切开手术，通过测量端口压、跨肺压或胸膜压以及气道中气体流速等参数，得出气道阻力等肺功能指标参数。与Hao-yan Jiao等[9]采用无创方法所测定Penh（增强呼吸间歇）不完全相同。实验结果显示，模型对照组的RI随着乙酰甲胆碱的浓度升高而逐渐升高，但是在乙酰甲胆碱的浓度为0.8 mg/mL时的气道阻力较较浓度为0.4 mg/mL时的气道阻力有所降低，考虑其一个可能原因是在浓度为0.8 mg/mL时相对于前几个浓度样本数量减少，豚鼠个体差异性大，最后获得数据的样本个体气道阻力值偏低；另一个可能原因和熏烟有关，一方面增加了咳嗽反应的敏感性，同时也增加了动物对乙酰甲胆碱激发反应的敏感性，可能导致乙酰甲胆碱浓度在0.4 mg/mL达到了最大能承受的激发浓度值，具体原因还需进一步实验证实。经过苏黄止咳胶囊和激素治疗，各组豚鼠的气道阻力在乙酰甲胆碱浓度为0.2 mg/mL、0.4 mg/mL时下降明显，且在3个浓度的乙酰甲胆碱（0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.8 mg/mL）激发下，苏黄止咳胶囊高、低剂量组的气道阻力值低于激素组，说明苏黄止咳胶囊在降低气道阻力值、减缓气道高反应的效果优于激素治疗。CVA的高反应性和气道阻力介于哮喘患者和正常人之间，暴露了气道的刺激感受器，对外界的各种理化因素刺激的敏感程度明显提高，故可以引起顽固性持续性咳嗽[10]。咳嗽是CVA唯一或是主要的临床表现，本实验采用辣椒素诱发咳嗽产生，测定豚鼠的咳嗽次数，其原理是通过雾化吸入特异性的刺激物，激活气道感觉神经末梢的咳嗽感受器，诱发咳嗽的产生，以激发物的浓度和咳嗽成都判断CRS[11]。造模组的豚鼠的咳嗽次数较正常对照组明显增多，说明模型是成功的，而经过中药和激素治疗，咳嗽次数减少，并且苏黄止咳胶囊高、低剂量组咳嗽次数较激素组少，说明苏黄止咳胶囊可以有效缓解豚鼠的咳嗽症状。气道慢性炎性反应是CVA的重要发病机制[12]，是以嗜酸性粒细胞浸润为主的气道炎性反应[13]。模型对照组的豚鼠BALF中嗜酸性粒細胞的百分比和细胞总数明显升高，经过苏黄止咳胶囊治疗的高、低剂量组嗜酸性粒细胞的百分率明显下降，说明了苏黄止咳胶囊可以减轻嗜酸性粒细胞的浸润状况，使嗜酸性粒细胞的百分率降低。

综上所述，实验中苏黄止咳胶囊可以改善CVA豚鼠模型的咳嗽症状，改善豚鼠模型的气道阻力以及减轻嗜酸性粒细胞的浸润。其作用机制可能通过减轻嗜酸性粒细胞的浸润，从而减轻炎性反应，同时降低气道阻力，减轻高反应性，以达到治疗目的。

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