从炎性细胞因子与Dickkopf—1变化研究补肾活血方对绝经后膝骨关节炎的干预作用

李明曦 张继胜 侯秀娟 朱跃兰

摘要 目的：研究自拟中药补肾活血方对绝经后膝骨关节炎（Knee Osteoarthritis，KOA）患者血清白细胞介素1（Interleukin 1，IL-1）、肿瘤坏死因子α（Tumor Necrosis Factor α，TNF-α）、雌二醇（Estradiol，E2）、Dickkopf-1（Dkk-1）水平的影响。方法：将60例符合标准的KOA患者随机分为治疗组与对照组，每组均30人。治疗组予自拟补肾活血方，1剂/d，分早晚2次服；对照组予双醋瑞因50 mg/d；疗程均为4周，测定患者治疗前后血清IL-1、TNF-α、E2、Dkk-1含量。结果：治疗组控显率与总有效率分别为60%、96.67%；对照组控显率与总有效率分别为53.33%、93.33%。实验室指标检测显示，2组治疗后血清IL-1、TNF-α水平均较治疗前降低（P<0.01）；2组治疗后的组间比较显示，IL-1含量差异无统计学意义（P>0.05），TNF-α含量差異有统计学意义（P<0.05）。血清E2水平检测结果显示，治疗组治疗后较治疗前增加（P<0.01），对照组治疗后较治疗前有所增加，但差异无统计学（P>0.05），治疗组与对照组治疗后的组间比较差异有统计学意义（P<0.01）。血清Dkk-1水平方面，2组治疗前后比较及2组治疗后组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。结论：绝经后KOA的主要病机为肾虚血瘀，补肾活血中药可改善绝经后KOA的症状；补肾活血方可能通过调节雌激素水平以及炎性细胞因子起到干预绝经后KOA的作用；补肾活血方对于Wnt信号通路中Dkk-1无明显作用，可能Wnt信号通路不参与补肾活血方的干预途径。

关键词 补肾活血；雌二醇；Dickkopf-1；绝经后膝骨关节炎；炎性细胞因子

Abstract Objective：To study the curative effect of Bushen Huoxue Decoction， nourishing kidney and removing blood stasis， on serum interleukin 1， tumor necrosis factor α， Estradiol and Dickkopf-1 level in patients with postmenopausal knee osteoarthritis. Methods：A total number of 60 patients with knee osteoarthritis meeting the diagnosis criteria were randomly divided into treatment group and control group with 30 patients in each group. Patients in the treatment group were given with Bushen Huoxue Decoction a dose and twice daily， while patients in the control group were taken Diacerein Capsule for 50 mg/d. The observation period was 4 weeks. The contents of IL-1， TNF-α， E2， Dkk-1 of all patients were detected before and after treatment. Results：In treatment group， the controlled effective rate was 60% and the total effective rate was 96.67%. While in the control group， the controlled effective rate was 53.33% and the total effective rate was 93.33%. Comparison in serum IL-1 and TNF-α of both the two groups before and after treatment within their groups showed that there was remarkably significant difference （P<0.01）. Comparison of the two groups after treatment between the group showed no significant difference for IL-1 （P>0.05） and significant difference for TNF-αcontent （P<0.05）. Serum E2 of the treatment group before and after treatment showed obviously significant difference （P<0.01）， while that of the control group before and after treatment indicated no significant difference （P>0.05）. Comparison after treatment between the group showed there was remarkably significant difference （P<0.01）. Serum Dkk-1， there were no significant differences within the two groups before and after treatment， and the same result between groups after treatment. Conclusion：The main pathogenesis of postmenopausal KOA may be due to kidney deficiency and blood stasis and Bushen Huoxue Decoction may well improve symptoms of postmenopausal knee osteoarthritis and intervene postmenopausal KOA by regulating the levels of estrogen and inflammatory cytokines. Bushen Huoxue Decoction has no obvious effect for Dkk-1 of Wnt signal pathway， and Wnt signal pathway may not participate in Bushen Huoxue Decoction intervention way.

Key Words Nourishing kidney and removing blood stasis； E2； Dkk-1； Postmenopausal knee osteoarthritis； Inflammatory cytokines

中图分类号：R285.6文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2017.02.025

骨关节炎（Osteoarthritis，OA）是以关节疼痛、压痛、活动受限、有骨摩擦音、局部炎性反应为临床表现，以不规则的软骨损害、软骨下骨硬化、骨赘增生、软骨下囊肿、滑膜炎、关节囊挛缩、肌肉萎缩、韧带松弛等为病理表现的一种退行性疾病，严重威胁人类健康和生活质量。其中KOA中老年以后最常见，KOA是引起中老年人活动不利、下肢疼痛不适的主要原因，该病虽不像肿瘤一样威胁着人类的生命，但因其患病率高，关节疼痛所导致的功能障碍严重影响患者的生活质量和社会公共卫生。流行病学研究发现，绝经后妇女的OA发病率明显增高，且严重程度加深，这也促使广大学者开展了对绝经后OA生理病理的研究。因此，本研究以绝经后KOA患者为研究对象，以补肾活血中药复方为干预手段，以Wnt信号通路及其相关因素DKK-1以及相关炎性反应因子为切入点，研究补肾活血中药治疗绝经后膝骨关节炎的临床疗效并初步探讨其相关机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2013年1月至2013年12月就诊于东方医院风湿科门诊及病房的绝经后女性膝骨性关节炎患者为本课题的研究对象。设计类型为随机对照临床试验，设计方法采用随机序列的产生（查询随机数字表）和随机隐藏（序列编码密闭不透光的信封）。样本量估算：本试验为小样本量探索性试验，为以后的大样本量试验研究提供数据与支持，故设治疗组与对照组为1∶1，每组各30例，由于本试验脱失率预设为10%，故共需纳入66例。

共纳入北京中医药大学东方医院风湿科2013年1月至12月住院患者66例，按照随机序列的产生与随机隐藏方法分为治疗组与对照组，在受试过程中出现6例脱落病例，最终确定为60例有效病例，每组各30人，年龄49～70岁。脱落原因为药物对症状改善不明显停止用药2例、病房患者治疗中途出院4例。

2组在年龄、病程间的差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。见表1。

1.2 诊断标准

1.2.1 西医诊断标准 符合1986年美国风湿病学会推荐的膝骨关节炎诊断标准，且为绝经后女性。

1.2.2 中医辨证标准 参照《中药新药临床运用指导原则》2002版中关于中药新药治疗骨关节炎的临床研究指导原则中中医症候诊断标准，辨证属肝肾亏虚，瘀血阻络证。

1.3 纳入标准 1）凡符合西医膝骨关节炎诊断标准；2）符合中医证候诊断标准证属肝肾亏虚，瘀血阻络型；3）年龄50～75岁绝经1年以上女性；4）接受非甾体抗炎药（NSAIDS）的患者进入试验前药物剂量需稳定至少30 d，并且在以后的治疗中药物剂量维持不变。接受其他病情改善药物治疗的患者须中断用药30 d以上；5）知情同意，愿意配合观察者。

1.4 排除标准 1）合并有类风湿关节炎、强直性脊柱炎、风濕性关节炎、大骨节病及痛风等其他风湿性疾病；2）关节不稳、严重变形、半月板损伤、严重肿胀积水、韧带撕裂等需要外科手术的严重患者；3）妊娠或哺乳期妇女；4）对治疗药物过敏者；5）合并有心脑血管、肝、肾和造血系统等严重原发疾病或精神疾病的患者；6）患者未按规定用药，无法判定疗效或资料不全无法判定疗效者；7）为非生理性停经妇女。主要包括严重贫血、营养不良、具体的内分泌疾病、严重的肺结核、下生殖道闭锁、生殖器发育不良等所引起的停经。

1.5 脱落标准 1）受试者依从性差，或合并使用本临床方案禁止使用的药物，或加用其他药物或中途自行换药的；2）观察中失访、自然脱落者，包括治疗有效，但不能完成整个临床观察疗程以致临床资料不全等影响治疗疗效和安全性判定的；3）发生严重不良事件与并发症，不能继续接受临床研究的。

1.6 治疗方法 治疗组：口服自拟补肾活血方，由补骨脂10 g、桑寄生15 g、川牛膝12 g、白芍12 g、骨碎补9 g、鸡血藤15 g、川芎15 g、穿山龙15 g等药物组成，所用中药饮片来自于北京同仁堂，采用韩国制造煎煮机煎熬。1剂/d，早晚各1次，疗程为4周。

对照组：予双醋瑞因胶囊口服，商品名称为安必丁，为胶囊剂型，由昆明积大制药股份有限公司提供，分装批准文号：国药准字J20100150。50 mg/粒，1次/d，疗程为4周。

1.7 IL-1、TNF-α的测定 取备检血清10 μL进行测定，采用双抗体一步夹心法。使用全波长荧光酶标仪在450 nm的波长下进行吸光度（OD值）的测定，并制作标准曲线计算样本浓度。由北京冬歌博业生物科技有限公司提供，生产批号201406，产品编号分别为DZE10081、DZE10110。

1.8 E2、DKK-1的测定 取备检血清10 μL进行测定，分别采用采用放免法、酶联免疫法。使用全波长荧光酶标仪，在450 nm的波长下进行吸光度（OD值）的测定，并制作标准曲线计算样本浓度。由北京冬歌博业生物科技有限公司提供，生产批号201405，产品编号分别为DZE10719、DZE10233。

1.9 血清提取 使用国产冷冻高速离心机，型号：珠海黑马医学仪器有限公司，产品型号：TGL-16R，生产许可证号：粤食药监械生产许20010350号，产品标准：YZB/粤珠0005-2006，编号：AQB018A。

1.10 观察指标 安全性指标：1）一般指标（血压、心率、呼吸、脉搏）；2）血尿便常规；3）肝肾功能；4）心电图；实验室指标：IL-、TNF-α、E2、Dickkopf-1。

1.11 疗效判定标准 中医症状疗效评定方法：采用尼莫地平法，即疗效指数=（治疗前评分-治疗后评分）/治疗前评分×100%。

1.12 统计学方法 本临床研究的计数资料采用χ2检验。计量资料，当数值正态时，组内治疗前后采用配对t检验，组间治疗前后采用独立样本t检验；数值非正态时，组内治疗前后比较采用2个相关样本的非参数比较，组间治疗前后比较采用2个独立样本的非参数比较。计量资料采用均数±标准差（±s）表示。数据统计分析均采用SPSS 13.0，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床总疗效评价 经χ2检验后显示，2组患者控显率比较差异无统计学意义（P=1.00>0.05），提示2组控显率相当；经秩和检验分析，Z=-0.712，P=0.471>0.05，提示2组患者的总有效率差异无统计学意义。见表2。

2.2 IL-1测定值比较 治疗组与对照组血清IL-1治疗前后比较显示，治疗组治疗后较治疗前降低（P<0.05）；对照组治疗后较治疗前降低（P<0.05）；治疗组与对照组治疗前IL-1值比较差异无统计学意义（P=0.959>0.05，t=0.051）；治疗组与对照组治疗后IL-1值比较差异无统计学意义（P=0.346>0.05，t=0.950）。见表3。

2.3 TNF-α测定值比较 治疗组与对照组血清TNF-α治疗前后比较显示，治疗组治疗后较治疗前降低（P<0.05）；对照组治疗后较治疗前降低（P<0.05）；治疗组与对照组治疗前TNF-α值比较差异无统计学意义（P=0.817>0.05，t=-0.232）；治疗组与对照组治疗后TNF-α值比较差异有统计学意义（P=0.000<0.05，t=-22.243）。见表4。

2.4 E2测定值的比较 治疗组与对照组血清E2治疗前后比较显示，治疗组治疗后较治疗前升高（P<0.05）；对照组治疗后较治疗前差异无统计学意义（P>0.05）；治疗组与对照组治疗前E2值比较差异无统计学意义（P=0.239>0.05，t=1.189）；治疗组与对照组治疗后E2值比较差异有统计学意义（P=0.000<0.05，t=27.253）。见表5。

2.5 Dickkopf-1测定值比较 治疗组与对照组血清Dkk-1治疗前后比较显示，治疗组治疗后较治疗前差异无统计学意义（P>0.05）；对照组治疗后较治疗前差异无统计学意义（P>0.05）；治疗组与对照组治疗前Dkk-1值比较差异无统计学意义（P=0.658>0.05，t=0.445）；治疗组与对照组治疗后Dkk-1值比较差异无统计学意义（P=0.784>0.05，Z=-0.274）。见表6。

3 讨论

Wnt/β-catenin信号通路无论在胚胎时期还是在出生后，对软骨、骨骼的分化及发育均起着重要的调节作用，但该通路在成年后处于低表达状态。Wnt/β-catenin信号通路在OA发病中的作用是近年来研究的热点，β-catenin是Wnt经典通路的核心分子，上游分子信号的传递需通过β-catenin才能发挥效应。维持β-catenin在细胞内的稳定是Wnt/β-catenin信号通路中最重要的事件之一，过度增加或抑制β-catenin都会导致OA的发生，但其发生机制各有不同。生理状态下，β-catenin可以促进软骨细胞成熟，抑制凋亡，但过多表达则会加速关节软骨细胞的成熟，刺激蛋白酶的活化，加速软骨基质的降解，最终导致关节软骨破坏。当表达过低时，关节软骨则会凋亡过度，不足以维持和修复正常的软骨，这些都说明β-catenin的表达异常与OA的发生密切相关。一些细胞外抑制因子对Wnt/β-catenin信号通路起着调节作用，其中DKK-1的作用尤为引人关注，Dkk-1通过抑制Wnt信号来抑制成骨细胞的分化，而促进破骨细胞的分化，进而改善OA的病理表现和临床症状，且Dkk-1基本上只作用于成骨细胞或（和）骨细胞，故调节Dkk-1可以只作用于骨骼系统以调节Wnt信号，而不影响其他器官。熊健斌[1]对新西兰白兔进行动物实验，构建KOA模型后分为空白对照组（注射1 mL生理盐水）、模型组（注射1 mL生理盐水）、Dkk-1组（等量0.07%纯化Dkk-1），结果显示Dkk-1组较另2组病情显著好转，可以说Dkk-1的升高对KOA起到了一定的治疗效果。甘坤宁[2]等研究显示，OA组患者血清DKK-1水平显著低于正常人组，可说明血清Dkk-1水平越高，对OA的发展越有抑制作用。也有不同的实验结果显示Dkk-1的高表达会导致OA的发生。在小鼠的动物实验中发现，Dkk-1的高表达会使小鼠发生骨质疏松，成骨细胞数量显著减少，而敲除Dkk-1的一组小鼠则表现为骨量的提高和成骨能力的增强[3-4]。还有国内学者进行相关研究，王超华[5]等观察KOA患者软骨组织中Wnt/β-catenin信号通路相关基因及蛋白的表达，得出β-catenin在软骨细胞中的高表达可能是导致关节软骨破坏的重要因素。许传勇[6]等观察β-catenin及其下游基因MMP-7在KOA大鼠滑膜细胞Wnt/β-catenin信号通路中的表达，结果显示其β-catenin、MMP-7含量显著增高，这说明Wnt/β-catenin信号通路在KOA大鼠滑膜细胞中是被激活的，该通路的活化可能是导致软骨降解、OA形成的机制之一。本次研究显示，2组治疗后比较差异无统计学意义（P>0.05）；治疗组与对照组治疗后较其治疗前均差异无统计学意义（P>0.05），因此还不能说明补肾活血方对Wnt信号通路相关因素DKK-1具有调节作用，这可能与本次研究样本量较少，观察时间较短有关。但从2组治疗前后均值来看，均比治疗前有所降低，可作为今后研究的参考。

绝经后女性患KOA的风险较绝经前显著升高，很多流行病学研究均显示女性绝经与KOA发病相关，并发现绝经越早，其发生KOA的可能性越大，所形成的骨赘严重程度较绝经期晚的女性更大。雌激素的作用受到了广泛关注，它可对细胞因子中的一种或者多种因子起到抑制作用，从而保护软骨组织，细胞因子和雌激素之间的相互作用也可以对破骨细胞产生明显影响；雌激素可以对组织和血清中的生长因子起到调节作用，而绝大部分生长因子对OA是有保护作用的；人和动物的关节软骨细胞上都有E2受体（α、β）的存在，这说明关节软骨是E2的靶组织，E2直接或者间接作用于滑膜细胞、软骨细胞、破骨细胞使其分泌各种因子，这些因子又对这些细胞的代谢和功能起到调节作用，这一过程对关节软骨起到了保护作用；雌激素还可以通过扩张肌肉血管来增加血供，從而为肌肉提供更多的营养物质，维持正常肌肉活动，以维持人体各大关节的稳定性。王伟[7]调查西安市城乡部分地区年龄40岁以上居民，男性704名，女性746名，调查显示女性OA发病率为17.2%，男性则为6.8%；女性骨赘出现率为26.5%，男性为11.4%，差异均有统计学意义。此项研究还提示随着绝经年龄的提前，KOA的发病率越高，骨赘的严重程度也越重。徐苓[8]等在北京市城区抽取60岁以上男性1012名和女性1507名，研究发现北京市老年妇女有46.6%人群可诊断为膝关节放射学OA，临床OA的患病率为15.4%；老年男性放射学OA和临床OA患病率分别为27.6%、7.1%，显著低于老年女性，这提示了雌激素与OA发病之间可能有密切关联。国外的一项研究显示[9]，在50岁之前男性患OA的概率是高于女性的，而在50岁之后，女性OA的患病率则明显高于男性，提示雌激素与KOA的发病密切相关。本项研究显示，治疗组治疗后E2水平明显增高，治疗组治疗后较其治疗前差异有显著统计学意义（P<0.01），而对照组治疗后较其治疗前差异无统计学意义（P>0.05），反映出补肾活血方可以上调E2水平。补肾活血方中配伍有川牛膝、桑寄生、骨碎补等补益肾气的药物，可以补充肾中精气，从而调节E2的含量。

IL-1被认为是导致软骨功能衰退最具影响力的细胞因子之一[10-11]，可促进软骨和滑膜组织中基质金属蛋白酶（Matrix Metalloproteinases，MMPs）的表达，刺激滑膜细胞产生中性蛋白酶和胶原酶等，进一步导致滑膜炎性病变[12]；也可使胶原纤维类型发生变异，加速蛋白多糖的消耗。IL-1可以通过介导白细胞介素6（Interleukin，IL-6）使软骨细胞合成蛋白多糖受到抑制，从而导致蛋白多糖产量下降，还可以促进关节软骨酶的产生和增强多种酶类的活性，进而促使胶原酶对胶原的降解、金属蛋白酶对基质蛋白多糖的消化。基质的异常结构又导致软骨细胞生存环境的恶化，形成了一个恶性循环，由此形成了OA软骨退变这一典型病理变化[13]。TNF-α是一种多功能的炎性反应细胞因子，是机体炎性反应与免疫反应的重要调节因子，TNF-α与IL-1仅有3%的同源性，且作用于不同的受体，但两者表现出了很多相似的生物学特征。当TNF-α处于较高浓度时，可产生与IL-1相同的作用，且2者作用可相互协同，协同作用可能是通过对产生TNF-α与IL-1的细胞相互正反馈调节及TNF-α可促进IL-1R蛋白磷酸化实现的[14]。由此可知，2者共同构成炎性反应递质，形成强烈的协同效应[15]。TNF-α还可以促进软骨细胞和成纤维细胞合成多种胶原酶，加强了对软骨基质的降解作用[16]。本项研究结果表明，由于补肾活血方中配伍了具有抗炎、抑制炎性反应细胞过度分泌及调节机体免疫功能等药理作用的中药，故该方药不仅可以强筋健骨，补益肝肾，还能很好的降低IL-1及TNF-α水平。

综上所述，肾虚血瘀是绝经后KOA发病的基本病机，自拟补肾活血方可缓解患者临床症状，同样可以降低血清中致炎因子IL-1、TNF-α水平，并且提高血清E2的含量，可以说明该处方是治疗绝经后KOA的有效临床制剂。在对Dkk-1的调节作用方面，本次研究结果未显示该指标有意义的比较结果。从国内外文献来看，Dkk-1的水平变化对OA的发生发展是有影响的，但补肾活血方对于调节Dkk-1的作用机制还需要进一步研究，Wnt信号通路涉及多个信号靶点，补肾活血方是否对其他靶点有干预作用将在今后的研究中进一步探讨。该研究因病例样本相对较少，可为今后大样本研究提供参考。

参考文献

[1]熊健斌，彭伟秋，孙宏志.Dkk-1干预对骨关节炎的治疗作用[J].广西医科大学学报，2014，31（5）：738-740.

[2]甘坤宁，熊健斌.Dkk-1与骨关节炎的关系[J].吉林医学，2012，33（6）：1171.

[3]Li J，Sarosi I，Cat tley RC，et al.Dkk1-mediated inhibition of Wnt signaling in bone result in osteopenia[J].Bone，2006，39（4）：754-766.

[4]Morvan F，Boulukos K，Clément-Lacroix P，et al.Deletion of a single allele of the Dkk1 gene leads to an increase in bone formation and bone mass[J].J Bone Miner Res，2006，21（6）：934-945.

[5]王超华，张子博，朱梅，等.Wnt/β-catenin信号通路与骨关节炎发病机制的研究[J].天津医药，2011，39（6）：483-486.

[6]许传勇，宋朋飞，阚卫兵，等.塞来昔布胶囊对大鼠膝骨性关节炎滑膜细胞β-catenin和基质金属蛋白酶-7的影响[J].广东医学，2013，34（5）：678-681.

[7]王伟，王坤正，党小谦，等.中老年膝骨关节炎发病的相关因素[J].中国临床康复，2006，10（44）：15-18.

[8]徐苓，Michael C Nevitt，Yuqing Zhang，等.北京城区老年人膝、髋和手骨关节炎的患病率及其与美国白人患病率的比较研究[J].中华医学杂志，2003，83（14）：1206-1209.

[9]Herndon JH.Osteoarthritis in women after menopause[J].Menopause，2004，11（5）：499-501.

[10]黄媛霞，段永壮，李康，等.膝关节OA患者血清和关节液中IL-1、MMP-3、TIMP-1的水平变化及意义[J].山东医药，2010，50（30）：59-60.

[11]陈益丹，邱华平，金肖青，等.针刺对膝骨关节炎模型兔血清白介素-1β、肿瘤坏死因子-α的影响[J].上海针灸杂志，2010，29（7）：468-470.

[12]潘新，张力，李昕，等.白介素-1在膝关节原发性骨关节炎中的作用[J].山东医药，2001，41（4）：20.

[13]潘海乐.白细胞介素1与骨性关节炎[J].医学综述，1999，5（11）：517-518.

[14]邓廉夫，柴本甫.IL-1、TNF、IL-6與骨关节炎[J].国外医学，1996，17（2）：102-106.

[15]MastsukawaA，Yoshimura T，Kazuhiko Miyamoto，et al.Analysis of the Inflamm-atory cytokine network among TNF-αIL-1βIL-receptoran tagonist and IL-8 i-n Lps Induced rabbit arthritis[J].Laboratory Investigation，2007，76（5）：629.

[16]Hinton R Moody RL，Davis AW，Thomas SF.Osteoarthritis：Diagnosis and Therapeudic considerations[J].Am Fam Physician 2002，65（5）：841-848.