人博卡病毒1型主要抗原NS1、NP1及VP1/2的抗体制备及应用

刘文宽，游爱萍，许 多，邱淑燕，周志超，李 炽，周 荣

(呼吸疾病国家重点实验室，广州医科大学附属第一医院，广州医科大学，广东 广州 510230)

人博卡病毒1型主要抗原NS1、NP1及VP1/2的抗体制备及应用

刘文宽，游爱萍，许 多，邱淑燕，周志超，李 炽，周 荣

(呼吸疾病国家重点实验室，广州医科大学附属第一医院，广州医科大学，广东 广州 510230)

人博卡病毒1型(human bocavirus 1，HBoV1)是全球流行的重要呼吸道病毒，其研究尚处于初期阶段。通过原核表达的方式对HBoV1主要抗原NS1、NP1、VP1/2进行蛋白表达，通过纯化、免疫小鼠成功获得3种蛋白的抗体血清，通过ELISA评价了抗体对相应蛋白抗原及临床HBoV1阳性样品的效价，并将所制备的抗体成功用于HBoV1广州株GU338055反向遗传系统的NS1、NP1、VP1/2的免疫荧光研究。结果表明，所制备抗体在1∶50稀释度时A450值对阴性对照约有4倍提升，为HBoV1后续深入研究提供了重要工具，具有重要意义。

人博卡病毒1型；NS1；NP1；VP1/2；抗体；免疫荧光

人博卡病毒1型(human bocavirus 1,HBoV1)是Allander等[1]于2005年首次在下呼吸道感染患者中发现的，归属于细小病毒科、细小病毒亚科、博卡病毒属。HBoV1粒子直径为26 nm，基因组约5.5 kb，是一种体积较小、具有二十面体衣壳、无包膜的单链线性DNA病毒，末端为反转重复序列(ITR)或发夹结构，为病毒复制所必须。HBoV1由左端唯一启动子启动基因转录，其后续蛋白产生及成熟的详细过程仍有待深入研究[2]。基因组序列、转录谱和表达谱分析表明，HBoV1主要表达2种衣壳蛋白(VP1和VP2)及2种非结构蛋白(NS1和NP1)，其中，VP1、VP2长度分别为672 aa、542 aa，具有典型的基因重叠区。VP1的N端为非重叠区，长度为129 aa，即VP1独特区(VP1-unique，VP1u)；后面为VP1和VP2的重叠区(VP1/2)，长度为542 aa，序列完全相同[3]。

HBoV1是一种全球流行的重要呼吸道病毒，可引起上、下呼吸道感染[4-5]。研究表明，感染HBoV1后会导致分化的组织样气道上皮细胞(HAE)的纤毛减少、紧密连接破坏、细胞肥大，这些与肺损伤的组织变化非常相似[2]，在一定程度上解释了HBoV1的致病机制。同时，HBoV1感染引起的气道上皮细胞纤毛的减少和紧密连接的破坏可能导致人体对外部病原体的抗感染屏障遭到破坏，从而对其它病原体易感，在一定程度上解释了HBoV1存在的高共感染率。这表明，HBoV1感染的影响可能不仅仅局限于自身疾病的产生，同时也导致其它病原体易感，其与AAV2/HBoV1形成的嵌合病毒有作为基因治疗载体的潜质[6]。

目前，HBoV1纯病毒除在三维分化的组织样呼吸道上皮细胞中能够正常感染增殖外，无法通过常规的细胞培养获得，采用反向遗传技术也只能获得少量HBoV1纯病毒[2]。所以，对HBoV1的研究还处于初级阶段，对其病毒包装、感染性及致病性的研究仍然迫切。

作者前期研究[5]中从一名60岁女性肺炎患者中获得了HBoV1广州株GU338055，在此对HBoV1主要抗原NS1、NP1、VP1/2进行原核表达、纯化，并通过免疫小鼠获得其抗体，拟为后续研究奠定基础。

1 实验

1.1 HBoV1广州株主要抗原NS1、NP1及VP1/2片段PCR扩增

1.1.1 引物设计

对HBoV1广州株主要抗原NS1(aa 640～781)、NP1(aa 1～219)、VP1/2(aa 369～475)片段进行PCR扩增引物设计，如表1所示。

表1 HBoV1广州株主要抗原片段PCR扩增引物

1.1.2 扩增反应

以前期获得HBoV1广州株时构建的反向遗传系统全长质粒作为模板，使用Ex Taq 50 μL体系(Takara)分别对NS1、NP1、VP1/2片段进行扩增反应。

扩增反应体系：HBoV1广州株核酸模板(质粒)0.5 μL,10×Ex Taq buffer(Mg2+Plus)5 μL,dNTP mixture(各2.5 mmol·L-1)4 μL,正向引物(10 μmol·L-1)1.5 μL,反向引物(10 μmol·L-1)1.5 μL,Ex Taq(5 U·μL-1)0.5 μL,ddH2O补足至50 μL。

扩增条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 变性15 s，52 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，30个循环；72 ℃延伸5 min。

1.1.3 扩增产物纯化

取2 μL 扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，使用TIANprep DNA gel extraction kit(天根生化科技(北京)有限公司)进行目标DNA的凝胶回收及纯化。

1.2 原核表达载体构建、蛋白表达及纯化

1.2.1 原核表达载体构建

利用pGEX-4T-3质粒构建HBoV1主要抗原原核表达载体pGEX-NS1、pGEX-NP1、pGEX-VP1/2。

(1)质粒与纯化的扩增片段酶切

用SalⅠ和NotⅠ(NEB)分别对pGEX-4T-3质粒及纯化的NS1、NP1、VP1/2扩增产物进行双酶切，于37 ℃水浴2 h，使用TIANprep DNA gel extraction kit进行目标DNA的凝胶回收及纯化。

50 μL酶切体系：NE buffer 3.15 μL、酶切目标核酸15 μL、SalⅠ 1 μL、NotⅠ 1 μL、ddH2O补足至50 μL。

(2)连接

使用T4 DNA ligase(NEB)分别连接酶切的pGEX-4T-3与NS1、NP1、VP1/2，构建原核表达载体pGEX-NS1、pGEX-NP1、pGEX-VP1/2，于16 ℃水浴2 h。

10 μL连接体系：T4 DNA ligation buffer 1 μL、pGEX-4T-3 酶切产物4 μL、NS1或NP1或VP1/2酶切产物4 μL、T4 DNA ligase 1 μL。

(3)转化

使用E.coliTOP10感受态细胞(天根生化科技(北京)有限公司)转化连接产物。步骤如下：冰上融化感受态细胞，吸取连接产物至感受态细胞中，冰浴30 min，42 ℃热激45 s，迅速转至冰浴2 min，加入无抗性LB培养基 500 μL至37 ℃摇床中250 r·min-1振荡培养1 h，取200 μL涂布含氨苄青霉素LB(LB-Amp+)固体平板，于37 ℃培养箱中倒置过夜培养。

(4)验证

挑取平板上的单菌落至含0.8 mL LB-Amp+液体培养基的1.5 mL离心管中，37 ℃、250 r·min-1培养4～5 h，使用菌落PCR进行阳性克隆筛选，即用表1中各片段扩增引物分别进行验证。

菌落PCR条件：单菌落培养物0.5 μL、10×Ex Taq buffer(Mg2+Plus)2.5 μL、dNTP mixture(各2.5 mmol·L-1)1 μL、正向引物(10 μmol·L-1)1 μL、反向引物(10 μmol·L-1)1 μL、Ex Taq(5 U·μL-1)0.2 μL、ddH2O补足至25 μL。

验证反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性 15 s，52 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，30个循环；72 ℃延伸5 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段。阳性克隆每种蛋白，挑选2例测序验证。

使用AxyPrep质粒DNA小量试剂盒(Axygen)分别提取最终确认正确的pGEX-NS1、pGEX-NP1、pGEX-VP1/2。使用0.5 μL提取质粒转化E.coliBL21感受态细胞(天根生化科技(北京)有限公司)，方法同前。

1.2.2 蛋白表达及纯化

(1)蛋白表达

用IPTG(Sigma)诱导蛋白表达，通过调整IPTG浓度、诱导时间、诱导温度使目标蛋白可溶。步骤如下：挑取pGEX-NS1、pGEX-NP1、pGEX-VP1/2阳性E.coliBL21分别接种至5 mL LB-Amp+液体培养基中，37 ℃摇床中250 r·min-1振荡培养过夜；分别取4 mL培养物接种至400 mL LB-Amp+液体培养基中，37 ℃摇床中250 r·min-1振荡培养3～4 h，加入IPTG进行蛋白诱导表达。3种蛋白的诱导条件分别为：pGEX-NS1，IPTG终浓度0.5 mmol·L-1、37 ℃、250 r·min-1诱导4 h；pGEX-NP1，IPTG终浓度0.2 mmol·L-1、20 ℃、250 r·min-1诱导16 h；pGEX-VP1/2，IPTG终浓度0.4 mmol·L-1、20 ℃、250 r·min-1诱导16 h。

(2)蛋白纯化

破碎细菌：5 000 r·min-1离心15 min，收集菌体，加入20 mL PBS重悬细菌，冰上超声(开20 s、停5 s、功率70%)10～20 min破碎细菌至菌液变青色。4 ℃、10 000 r·min-1离心30 min，得上清。

纯化树脂准备：将GST-Bind Resin(Novagen)亲和纯化树脂重悬并吸取2 mL至50 mL离心管中，4 ℃、500×g离心5 min，吸弃上清；加入20 mL 预冷的PBS重悬树脂洗去乙醇，4 ℃、500×g离心5 min，吸弃上清；加入1 mL 预冷的PBS重悬树脂，备用。

纯化：将破碎细菌上清液加至准备好的纯化树脂中，室温下轻摇30 min；转移混合物至柱子中，注意树脂中不要有气泡；用15 mL 预冷的PBS洗柱子3次；用含还原性谷胱甘肽的洗脱液洗脱目标蛋白；用10 kDa超滤管(Millipore)浓缩目标蛋白；12% SDS-PAGE检测目标蛋白，Bradford法测定蛋白浓度。

1.3 小鼠免疫及效价评价

1.3.1 小鼠免疫

取100 μL目标蛋白(50 μg)，用100 μL完全弗氏佐剂(Sigma)充分乳化，腹腔注射BALB/c 六周龄小鼠，总计4次免疫。免疫后取血清。

1.3.2 效价测定

用制备的抗原及临床HBoV1阳性样品分别进行ELISA抗体评价。将制备的抗原或临床HBoV1阳性样品用包被液稀释到4 μg·mL-1，酶标板每孔加入100 μL,4 ℃包被24 h；弃孔中液体，用150 μL封闭液于37 ℃封闭2 h；弃孔中液体并洗涤5次，每次3 min；加入不同稀释度的血清样品进行检测，以未免疫小鼠血清作为阴性对照，37 ℃放置30 min；用洗涤液满孔洗涤5次,每次3 min；加入酶标抗体(HRP-羊抗鼠)，37 ℃放置30 min；洗涤5次后，用TMB-过氧化氢尿素溶液底物反应(Millipore)，37 ℃避光放置3～5 min,加入终止液显色，测A450值。

1.4 抗体在HBoV1免疫荧光实验中的应用

用所制备的抗体血清对电转HBoV1反向遗传系统全长质粒的AD293细胞进行HBoV1的免疫荧光实验：用LONZA电转试剂电转质粒至AD293细胞，电转后培养在24孔板中，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养48 h。用所制备抗体进行其主要抗原NS1、NP1及VP1/2的免疫荧光检测。步骤如下：24孔板中细胞用PBS浸洗3次，每次3 min；用4%多聚甲醛固定15～30 min，PBS浸洗孔3次，每次3 min；0.5%Triton X-100(PBS配制)室温通透20 min，PBS浸洗孔3次，每次3 min；吸干PBS，在孔中加入正常10%山羊血清，室温封闭30 min；吸弃封闭液，每孔加足够量的稀释(1∶50)制备一抗血清，以阴性小鼠血清作为阴性对照，湿盒中37 ℃放置1 h；PBST 浸洗孔3～6次，每次3 min；吸干孔中多余液体后滴加稀释好的荧光二抗(FITC-羊抗鼠)(联科生物)，湿盒中37 ℃孵育1 h，PBST浸洗孔3次，每次3 min(注意：从加荧光二抗起，后面所有操作都尽量在较暗处进行)；吸干孔中液体，用含抗荧光猝灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。

2 结果与讨论

2.1 HBoV1主要抗原片段原核表达载体构建

通过PCR扩增获得了主要抗原NS1、NP1及VP1/2的目标片段(图1)，利用pGEX-4T-3构建了原核表达载体pGEX-NS1、pGEX-NP1、pGEX-VP1/2(图2)，并最终通过测序验证正确。

M.DNA marker

2.2 蛋白表达与纯化

在不同诱导条件下，获得了HBoV1 主要抗原NS1、NP1及VP1/2的目标片段可溶性表达，通过GST亲和层析，获得了GST融合蛋白：GST-NS1(41.62 kDa)、GST-NP1(50.09 kDa)、GST-VP1/2(37.77 kDa)，浓度分别为188 μg·mL-1、523 μg·mL-1、373 μg·mL-1，如图3所示。

M.DNA marker 1,4.pGEX-4T-3 2,3.pGEX-NP1 (其中3被证实为非目标质粒) 5.pGEX-VP1/2 6.pGEX-NS1

M.蛋白marker

2.3 免疫与抗体效价

通过免疫BALB/c小鼠，获得一批免疫血清，分别使用蛋白抗原和临床HBoV1阳性样品对其进行评价，结果见表2、3。

从表2可知，使用NS1、NP1、VP1/2蛋白抗原进行评价时，与阴性小鼠血清对比，3种主要抗原的A450值升高2倍以上的稀释度分别起始于1∶80 000、1∶40 000和1∶160 000。从表3可知，使用临床HBoV1阳性样品进行评价时，与阴性小鼠血清对比，3种主要抗原的A450值在稀释度为1∶50的情况下都约有4倍提升。

2.4 抗体在HBoV1免疫荧光实验中的应用

以1∶50稀释度的制备抗体作为一抗，以阴性小鼠血清作为一抗对照，以FITC-羊抗鼠作为二抗，用所制备的抗体对利用反向遗传系统制备的HBoV1进行主要抗原的检测，结果如图4所示。

表2 蛋白抗原ELISA检测不同血清稀释度下的A450值

注：设置3个平行复孔，数据为A450值mean±sd,下表同。

表3 临床HBoV1阳性样品ELISA检测不同血清稀释度下的A450值

从图4可以看出，相关抗原分布在细胞中。

2.5 讨论

HBoV1是全球流行的重要呼吸道病毒，由于其无法在常规的呼吸道病毒培养细胞中培养分离，难以获得纯病毒，目前只发现在分化的组织样呼吸道上皮细胞中能够感染与增殖，未建立相应的动物模型，所以对其感染与致病机制还需更进一步的研究。

图4 所制备抗体对HBoV1主要抗原的免疫荧光检测结果(200×) Fig.4 Immunofluorescence detection results of HBoV1 major antigens using prepared antibody(200×)

本研究针对HBoV1主要抗原NS1、NP1、VP1/2进行抗体制备。利用pGEX-4T-3质粒成功构建了pGEX-NS1、pGEX-NP1、pGEX-VP1/2 GST融合表达载体。为了使目标蛋白处于可溶状态，保证亲和层析的顺利进行，针对3种蛋白分别采用了不同的诱导条件，低温低IPTG诱导条件保证了NP1、VP1/2的可溶性表达，纯化效果较好；但NS1的纯化效果相对较差，有较多的杂蛋白，虽然进行了改进，但效果不明显。

本研究通过腹腔免疫小鼠获得抗体血清，并分别利用目标蛋白抗原和临床HBoV1阳性样品评价抗体效价。在利用临床HBoV1阳性样品进行评价时，3种血清在1∶50稀释度时A450值均可获得约4倍提升，满足样品后续的实验应用。

本研究以所制备的抗体作为一抗进行了针对HBoV1广州株反向遗传系统电转制备的病毒的免疫荧光检测，获得了良好的效果。

3 结论

针对HBoV1主要抗原NS1、NP1、VP1/2，通过原核表达的方式进行蛋白表达，并通过纯化、免疫小鼠成功获得了3种蛋白的抗体血清，通过ELISA评价了抗体对相应蛋白抗原及临床HBoV1阳性样品的效价。结果表明，制备抗体在1∶50稀释度时A450值对阴性对照约有4倍提升，并成功用于HBoV1广州株GU338055反向遗传系统的NS1、NP1、VP1/2的免疫荧光研究中。为HBoV1后续深入研究提供了重要的工具，具有重要意义。

[1] ALLANDER T,TAMMI M T,ERIKSSON M,et al.Cloning of a human parvovirus by molecular screening of respiratory tract samples[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2005,102(36):12891-12896.

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PreparationandApplicationofAntibodiesAgainstMajorAntigensNS1,NP1,andVP1/2ofHumanBocavirus1

LIU Wen-kuan,YOU Ai-ping,XU Duo,QIU Shu-yan,ZHOU Zhi-chao,LI Chi,ZHOU Rong

(StateKeyLaboratoryofRespiratoryDiseases,GuangzhouMedicalUniversity,TheFirstAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510230,China)

Human bocavirus 1(HBoV1) is an important respiratory virus in the world,and its research is still at an early stage.We expressed the major antigens NS1,NP1,and VP1/2 of HBoV1 by prokaryotic expression,obtained successfully the antibody serums of three proteins by purification and immunization of the mouse,and evaluated the titers of antibodies by ELISA for the corresponding protein antigens and clinical HBoV1 positive sample.Meanwhile,the prepared antibodies were successfully applied in the immunofluorescence study of NS1,NP1,and VP1/2 of HBoV1 Guangzhou strain GU338055 reverse genetic system.The results indicated that,theA450values of the antibodies prepared at 1∶50 dilution were about 4 times higher than that of the negative control,which provided an important tool for the further study of HBoV1,and would be of important significance.

human bocavirus 1;NS1;NP1;VP1/2;antibody;immunofluorescence

国家自然科学基金(青年基金)项目(31500143)

2017-08-07

刘文宽(1982-)，男，安徽六安人，博士，助理研究员，研究方向：临床病毒学，E-mail：ahlwk2000-2004@163.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.12.002

刘文宽，游爱萍，许多,等.人博卡病毒1型主要抗原NS1、NP1及VP1/2的抗体制备及应用[J].化学与生物工程，2017，34(12)：4-9.

R373 Q78

A

1672-5425(2017)12-0004-06