非生物诱导子茉莉酸甲酯和水杨酸对半夏悬浮细胞中生物碱代谢的影响

段永波，鲁放，崔婷婷，赵丰兰，滕井通，盛玮，张爱民，薛建平

淮北师范大学生命科学学院资源植物生物学安徽省重点实验室，安徽 淮北 235000

非生物诱导子茉莉酸甲酯和水杨酸对半夏悬浮细胞中生物碱代谢的影响

段永波，鲁放，崔婷婷，赵丰兰，滕井通，盛玮，张爱民，薛建平

淮北师范大学生命科学学院资源植物生物学安徽省重点实验室，安徽 淮北 235000

目的 研究非生物诱导子茉莉酸甲酯（MeJA）和水杨酸（SA）对半夏悬浮细胞系生物碱含量及相关酶活性的影响。方法 以叶柄来源的愈伤组织建立半夏悬浮细胞系，调查不同培养时间、MeJA和SA浓度对细胞中生物碱含量的影响，并分析生物碱合成相关酶（IMP脱氢酶、sAMP合成酶）的活性。结果 悬浮培养21 d时，悬浮细胞干重（DW）为培养前9倍，且生物碱总量为培养前3倍。MeJA和SA处理均能显著促进生物碱在半夏悬浮细胞中累积。150 µmol/L MeJA处理组生物碱含量为对照组3.6倍，达4.7 mg/g DW；50 µmol/L SA处理使悬浮细胞生物碱含量达到对照组的2.5倍。100 µmol/L MeJA和50 µmol/L SA处理使IMP脱氢酶比活力分别为对照组3.0、3.7倍，150 µmol/L MeJA和100 µmol/L SA处理使sAMP合成酶比活力分别为对照组2.6、4.4倍。结论 添加适量外源诱导子MeJA和SA能促进半夏悬浮细胞中生物碱的累积。

半夏；悬浮细胞；生物碱；茉莉酸甲酯；水杨酸

半夏Pinellia ternata（Thunb.）Breit.为天南星科多年生草本植物，其药用功效最早记载于《神农本草经》。半夏以块茎入药，具有燥湿化痰、止咳镇痛的作用，已成为我国最常用的十大中药之一[1]。半夏富含生物碱、β-谷甾醇、多糖、挥发性油等，其中生物碱被视为其主要活性成分[2]。在半夏生物碱中，胡芦巴碱含量常被作为半夏质量控制指示，肌苷则用作半夏的鉴别性成分[3-4]。

作为大宗中药材，半夏年需求量达500～600万kg，而野生和人工栽培产量仅能满足1/3，市场缺口很大[5]。自然状态下，半夏极少进行有性生殖，主要通过珠芽或块茎进行营养繁殖，繁殖系数低[6]。长期过度采伐导致野生半夏资源濒于枯竭，而人工栽培依然面临高温、干旱、病虫害以及人工成本等多方面因素的影响，难以满足半夏药材的市场需求。

悬浮细胞可在人为控制条件下实现活性功能成分的生产，为解决药用植物资源不足和成本控制提供了新途径[7]。茉莉酸甲酯（MeJA）和水杨酸（SA）为重要的信号分子[8]，常被用于植物次生代谢途径研究。本研究以半夏悬浮细胞系为研究对象，考察外源MeJA和SA对生物碱合成和相关代谢酶活性的影响，以期为利用半夏悬浮细胞系生产生物碱提供依据。

1 仪器与试药

柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液（pH 5.4）、氯仿及溴麝草酚蓝标准溶液，购自生工生物工程（上海）股份有限公司；6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）、6-糠氨基嘌呤（KT）、茉莉酸甲酯（MeJA）、水杨酸（SA）及盐酸麻黄碱等试剂均为Sigma-Aldrich产品。试验所用半夏植株采自淮北市龙脊山自然风景区（E-116°23′，N-34°14′），经薛建平教授鉴定为宿半夏Pinellia ternata（Thunb.）Breit。

2 方法与结果

2.1 半夏悬浮细胞体系构建

半夏愈伤组织诱导培养基为MS＋3%蔗糖＋2.0 mg/L 6-BA＋2.0 mg/L 2,4-D＋2.0 mg/L KT＋0.65%琼脂，pH 5.8；细胞悬浮培养基为MS＋3%蔗糖＋0.5 mg/L 6-BA＋1.0 mg/L 2,4-D，pH 5.8[9]。愈伤组织诱导培养条件为25 ℃黑暗培养；悬浮细胞培养条件为（23±1）℃，光照周期为14 h/10 h光暗交替，光照强度为3000 lx。

取半夏叶柄置于0.1%氯化汞浸泡6 min，无菌水润洗5次后剪成约1.0 cm长段，接种至愈伤诱导培养基，于25 ℃黑暗培养。3周后获得愈伤组织，将所获愈伤组织继代培养3～5次。选取质地松脆的颗粒状愈伤接种至液体培养基进行悬浮培养（100 r/min），每15 d更换新培养基，直至获得稳定细胞系。将所获细胞系在8 ℃低温处理24 h，然后于25 ℃恢复培养36 h使细胞周期同步。之后在23 ℃培养9 d使同步化细胞进入对数生长期，获得半夏悬浮细胞系。

2.2 盐酸麻黄碱标准曲线的绘制

精密称取10 mg盐酸麻黄碱对照品溶解于氯仿中，定容至50 mL，摇匀，得0.20 mg/mL盐酸麻黄碱对照品溶液。精密吸取0、1、2、3、4、5 mL至分液漏斗内，添加蒸馏水补至5 mL，分别精密加入5 mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液（pH 5.4）、10 mL氯仿及1 mL溴麝草酚蓝标准溶液，充分振摇后静置1 h，分取氯仿层，水层再用氯仿重复萃取2次，每次10 mL。合并氯仿层，60 ℃水浴回收至干，用氯仿溶解，定容至10 mL[10]。于414 nm波长处分别测定其吸光度。以盐酸麻黄碱浓度（C）为横坐标、吸光度（A）为纵坐标，求得标准曲线为A＝0.062C－0.076 8，r2＝0.996 0（n＝5）。

2.3 生物碱含量测定

整个培养周期持续28 d，每隔7 d取样，所获样品立即保存于-70 ℃冰箱供测试分析。将所收集悬浮细胞样品于50 ℃干燥后研磨成粉。准确称取0.1 g样品粉末置于25 mL具塞试管中，加浓氨水0.5 mL润湿，加氯仿10 mL后于4 ℃冷浸3 h；冰浴超声提取1 h后过滤，残渣以10 mL氯仿分3次（4、3、3 mL）洗涤；将滤液与洗液合并，回收氯仿至干，加入10 mL氯仿使其溶解并转移至50 mL分液漏斗中，精密加入5 mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH 5.4）和1 mL溴麝香草酚蓝标准溶液，充分振摇后，静置1 h。分取氯仿层，水层再用氯仿同法萃取2次，每次10 mL。合并氯仿层，回收至干，残留物用氯仿溶解，置于10 mL容量瓶中，并用氯仿定容、摇匀，即得处理组溶液[11]。取待测溶液2.0 mL，用DU730 Beckman Coulter核酸蛋白分析仪测其吸光度，代入盐酸麻黄碱标准曲线中，计算生物碱的含量。

2.4 培养时间对悬浮细胞系生物量和生物碱含量的影响

2组患者干预前的步行功能状况比较P>0.05,干预后,2组患者的步行功能状况均得到改善,且实验组患者的步行功能状况显著优于常规组患者,P<0.05。见表1:

以半夏叶柄为外植体诱导愈伤组织，进行液体悬浮培养，获得半夏悬浮细胞系。随着培养时间延长，悬浮细胞干重总体呈现增长趋势，在21 d时细胞干重为培养前9倍，之后有所下降（见图1）；生物碱含量在培养7 d内含量较低，到14 d时显著增加，21 d时最高，达到1.56 mg/g DW，之后生物碱含量开始降低（见图2）。当培养时间超过28 d后，悬浮细胞会逐渐变为褐色，开始坏死。根据细胞生物量和生物碱含量测定结果，选择21 d作为悬浮细胞培养时间。

图1 培养时间对半夏悬浮细胞生长的影响

图2 培养时间对半夏悬浮细胞生物碱含量的影响

2.5 茉莉酸甲酯和水杨酸对生物碱含量的影响

试验用MeJA和SA浓度均为0、50、100、150、200 µmol/L。MeJA处理对半夏悬浮细胞系生物碱含量有显著影响。除50 µmol/L处理外，所试其他MeJA浓度均显著促进半夏生物碱合成。以150 µmol/L MeJA处理组最高，达到4.7 mg/g DW。150 µmol/L MeJA处理组的生物碱含量为对照组的3.6倍。在SA处理中，50和100 µmol/L可显著提高半夏悬浮细胞系中生物碱的合成，更高浓度的SA则能促进生物碱的累积。50 µmol/L SA处理组生物碱含量最高，为对照组的2.5倍。结果见图3。

图3 MeJA和SA对半夏悬浮细胞生物碱含量的影响

2.6 茉莉酸甲酯和水杨酸对IMP脱氢酶和sAMP合成酶活性的影响

在添加不同浓度MeJA或SA培养21 d后，测定半夏悬浮细胞中IMP脱氢酶和sAMP合成酶活性。取不同浓度外源激素的半夏悬浮培养细胞各1.0 g置于预冷的研钵中，加提取介质在冰浴中研磨匀浆，4 ℃、1000 r/min离心15 min，上清液为酶粗提取液。将上述酶提取液加入相应的酶反应液，每隔30 s读取吸光度值。酶活性以比活力表示，定义为1 min内1 mg蛋白所能引起的吸光度值变化的1000倍[5]。

添加MeJA或SA均对IMP脱氢酶活性有显著影响。50～150 µmol/L MeJA为对照组IMP脱氢酶活性2.6～3.1倍，当MeJA浓度增加至200 µmol/L时，酶活性有所下降；50 µmol/L SA处理对IMP脱氢酶活性影响最大，酶活性为对照组3.7倍，随浓度增加酶活性逐渐下降。结果见图4。

图4 MeJA和SA对半夏悬浮细胞IMP脱氢酶活性的影响

对于sAMP合成酶，50 µmol/L MeJA对酶活性无显著影响（P＞0.05），而较高浓度的MeJA显著提高酶活性（P＜0.05）。100、150、200 µmol/L MeJA分别为对照组sAMP合成酶活性2.2、2.6、1.9倍。在所测试SA浓度中，50～200 µmol/L SA均显著促进酶活性的升高，最高值出现在100 µmol/L SA处理组，酶活性为对照组4.4倍，之后随着SA浓度增加，酶活性逐渐下降，但至200 µmol/L浓度时，sAMP合成酶活性依然显著高于对照组。结果见图5。

图5 MeJA和SA对半夏悬浮细胞sAMP合成酶活性的影响

3 讨论

生物碱为重要的次生代谢物，是许多药用植物的主要活性成分。目前多种药用植物细胞内生物碱合成及代谢规律逐步得以揭示，对于研究这些植物的药用成分意义重大[12]。在诸多研究模式中，悬浮细胞系的应用极为广泛[13-14]，因其可为药用成分的生产提供另一途径，有助于解决药用植物产量的缺口，获得更高质量的产品，同时保护野生资源。

本研究以叶柄来源的愈伤组织建立半夏悬浮细胞系，考察不同培养时间、MeJA和SA浓度对细胞中生物碱含量的影响，并分析生物碱合成相关酶活性。

在悬浮培养21 d时，半夏悬浮细胞干重增加了9倍，悬浮细胞中生物碱总量为培养0 d时的3倍，与Zhao J等[15]报道长春花悬浮细胞培养增殖结果接近。生物碱作为一种重要的次生代谢产物，其合成通常在细胞培养后期进行。添加较低浓度MeJA或SA不会影响半夏悬浮细胞的增殖，这在麻花艽悬浮细胞培养中同样得到验证[16]。同时，培养3周左右通常需要更换新鲜培养基，以补充营养成分并减少坏死细胞对培养的影响。因此，确定悬浮细胞系培养时间为21 d用于不同诱导子对生物碱累积影响的研究。

MeJA或SA作为重要的诱导子已用于萜类化合物等生物碱的代谢研究[17]。本研究表明，MeJA或SA处理均能显著促进生物碱在半夏悬浮细胞中累积。培养21 d后，150 µmol/L MeJA处理组生物碱含量为对照组3.6倍，50 µmol/L SA处理组悬浮细胞生物碱含量达到对照组的2.5倍。同时测定了生物碱中嘌呤核苷酸生物合成途径中的关键酶IMP脱氢酶和sAMP合成酶活性的变化情况。添加MeJA或SA均能显著提高二者的酶活性。100 µmol/L MeJA、50 µmol/L SA处理使IMP脱氢酶活性分别为对照组3.0、3.7倍，150 µmol/L MeJA、100 µmol/L SA处理使sAMP合成酶活性分别为对照组2.6、4.4倍。比较生物碱累积量及所测代谢酶活性变化情况发现，生物碱累积与所测代谢酶活性变化趋势较一致，说明IMP脱氢酶及sAMP合成酶在半夏生物碱代谢中具有较为重要的作用。

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Effects of Abiotic Elicitors MeJA and SA on Alkaloids Accumulation and Related Enzymes Metabolism in Pinellia ternata Suspension Cell Cultures

DUAN Yong-bo, LU Fang,

CUI Ting-ting, ZHAO Feng-lan, TENG Jing-tong, SHENG Wei, ZHANG Ai-min, XUE Jian-ping (Key Laboratory of Resource Plant Biology of Anhui Province, College of Life Sciences, Huaibei Normal University, Huaibei 235000, China)

Objective To study the effects of abiotic elicitors methyl jasmonate (MeJA) and salicylic acid (SA) on the alkaloids accumulation and related enzymes metabolism in Pinellia ternata suspension cell cultures. Methods Using the leaf petioles-derived suspension cell cultures as the study object, the culture duration, concentrations of MeJA and SA were determined to get the optimal alkaloids accumulation, and the activities of metabolic enzymes IMP dehydrogenase and sAMP synthase were also measured. Results A 9-fold of dried biomass and a 3-fold of alkaloids accumulation were observed in P. ternata suspension cell cultures after culture for 21 d. Both MeJA and SA could significantly promote the accumulation of alkaloids in P. ternata suspension cells. 150 µmol/L MeJA enhanced alkaloids content (4.7 mg/g DW) by 3.6 folds in comparison with control group, whereas 50 µmol/L SA showed a 2.5-fold increase. Meanwhile, 100 µmol/L MeJA and 50 µmol/L SA promoted the increase in IMP dehydrogenase activity by 3.0 and 3.7 fold respectively, and 150 µmol/L MeJA and 100 µmol/L SA showed the increase by 2.6 and 4.4 fold respectively. Conclusion Proper adding exogenous MeJA and SA can promote the accumulation of alkaloids in Pinellia ternata suspension cell cultures.

Pinellia ternata; suspension cell cultures; alkaloids; methyl jasmonate; salicylic acid

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.01.021

R282.6

A

1005-5304(2017)01-0087-04

国家自然科学基金（31501368、81573518）；安徽省自然科学基金（1408085MC58、1608085MC52）；安徽高校省级自然科学研究项目（KJ2016B016、KJ2015ZD35）

薛建平，E-mail：xuejp@163.com