高效液相色谱法测定替格瑞洛含量

郭 盼 ，吕久安 ，张克军 ，张 凯 ，彭效明 ，晁建平

（1．北京石油化工学院，北京 102600； 2．北京红惠新医药科技有限公司，北京 102600）

高效液相色谱法测定替格瑞洛含量

郭 盼1，吕久安2，张克军2，张 凯1，彭效明1，晁建平1

（1．北京石油化工学院，北京 102600； 2．北京红惠新医药科技有限公司，北京 102600）

目的建立测定替格瑞洛含量的高效液相色谱法。方法色谱柱为Agilent ZORBAX SB－C18柱(250mm×4．6mm，5 m)，以乙腈－水（50∶50）为流动相，检测波长为254 nm，柱温为35℃，流速为1．0m L／min。结果主峰与前后杂质峰分离度为2．95和5．29；进样精密度的 RSD为0．07%；当色谱条件有微小变化时，主峰与前后杂质峰分离度大于1．5；质量浓度线性范围为0．03005～0．45075 g／L，线性回归方程为 Y＝17202X－29．492，R2＝0．9989；重复性试验的 RSD为 0．10%；中间精密度试验的 RSD为 0．21%；回收率范围为98．32% ～100．86%，RSD＝0．95%。结论该测定方法操作简单，准确性、重复性好，可用于控制替格瑞洛原料药的含量。

高效液相色谱法；替格瑞洛；原料药；含量测定

急性冠脉综合征（acute coronary syndrome，ACS）是由于粥样硬化的冠状动脉内斑块破裂引发血栓形成的临床综合征，近年来已成为我国主要的致死疾病之一[1]。其治疗刻不容缓，其中抗血小板治疗尤为重要[2]。替格瑞洛是阿斯利康公司推出的首个环戊基三唑嘧啶类药物，为口服可逆性P2Y12受体拮抗药，可阻断二磷酸腺苷（ADP）引导的血小板聚集[3－4]。与噻吩并吡啶类药物（如氯吡格雷）在血小板的生命周期中与P2Y12的不可逆结合不同，替格瑞洛与受体结合可逆，表现为起效和抗血小板聚集作用消失的迅速性[5]。动物实验显示，与噻吩并吡啶类药物不同，替格瑞洛抗血栓形成的作用与引发出血的作用是分离的；它无需代谢活化即可迅速吸收，显示强而持久的抗血小板聚集作用，同时维持剂量服药间隔也长于氯吡格雷。停药后，抗血小板凝聚作用随血药浓度降低而快速下降。此外，由于替格瑞洛是选择性P2Y12受体抑制剂，可拮抗ADP－介导血小板的活化和聚集，从而可预防血栓[6]。替格瑞洛主要由CYP3A4代谢成为主要活性产物AR－C124910 XX，其活性代谢产物是弱的P－糖蛋白底物和抑制剂。活性代谢产物的全身暴露量为替格瑞洛的30% ～40%[7]。替格瑞洛主要通过肝脏代谢，给予放射标记的替格瑞洛，尿中替格瑞洛及其代谢产物均低于1%；替格瑞洛及其代谢产物主要的排泄途径可能是胆汁排泌两者的半衰期分别为7 h和9 h[8]。年龄、性别、种族及肾功受损、轻度肝损害对药动学参数的影响不大[9]。

上市销售的替格瑞洛（Ticagrelor，又名替卡格雷）的商品名称是倍林达（替格瑞洛片），英文商品名称是BRILINTA（Ticagrelor Tablet），化学名称是（1S，2S，3R，5S）－3－（7－（（1R，2S）－2－（3，4－二氟苯基）环丙氨基）－5－丙硫基－3H－[1，2，3]三唑[4，5－d]嘧啶－3－基）－5－（2－羟乙氧基）环戊烷－1，2－二醇[10]。为研究原料药替格瑞洛的含量测定方法，本研究中曾尝试使用滴定法[11－12]对替格瑞洛进行含量测定，未发现明显的滴定终点。后又尝试使用紫外分光光度法[13]测定含量，但准确率较低。最后选用高效液相色谱（HPLC）法测定其含量。目前，已有一些厂家在进行该药的仿制研发工作，但该药的质量控制研究报道还很少，在目前药物研发领域对药物一致性评价日益要求严格和迫切的今天，本研究旨在为替格瑞洛原料药的开发提供帮助。

1 仪器与试药

1．1 仪器

1200型高效液相色谱仪（美国Agilent公司），TB－215D型十万分之一电子分析天平（美国Denver公司）。

1．2 试药

乙腈（Honeywell，色谱纯），水（屈臣氏，蒸馏水），其他试剂均为分析纯。相关试药均由北京红惠新医药科技有限公司提供，详见图1和表1。

图1 各类替格瑞洛结构图

表1 替格瑞洛方法验证相关样品及来源

2 方法与结果

2．1 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB－C18柱（250 mm×4．6mm，5 μm）；检测波长：254 nm；柱温：35℃；流动相：乙腈－水（50 ∶50）；流速：1．0 m L ／min；进样量：10 μL；稀释剂：50%乙腈；洗脱模式：等度洗脱[14]。

2．2 溶液制备

专属性溶液：取替格瑞洛杂质A和杂质B约1mg，另称取替格瑞洛样品30mg，精密称定，置100m L容量瓶中，加50%乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。

对照品溶液：称取替格瑞洛工作对照品30 mg，精密称定，置100mL容量瓶中，加50%乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。

样品溶液：称取替格瑞洛样品30mg，精密称定，置100m L容量瓶中，加50%乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。

空白溶液：水－乙腈 ＝1∶1（V／V）。

2．3 方法学考察

系统适用性试验：替格瑞洛杂质A和杂质B为替格瑞洛中与主峰分离度最小的杂质，属于液相较难区分的杂质。本方法的目的是通过优化方法使主峰与杂质A和杂质B达到理想的分离效果[3]。为此，取专属性溶液进样，通过改变色谱条件试验，使替格瑞洛杂质A、替格瑞洛杂质B与替格瑞洛达到基线分离（图2）。替格瑞洛样品方法的研究及验证参照《中国药典》规定的既定流程进行[15]。

进样精密度考察：取对照品溶液，按拟订色谱条件连续进样5针，记录主峰峰面积。结果5次测定的峰面积分别为 5104．90，5107．61，5114．43， 5106．55，5109．60，平均 5108．62，RSD 为 0．07% ，小于 2．00%，表明仪器精密度良好。

专属性考察：取专属性溶液，按拟订色谱条件进样。结果主峰与杂质 A和杂质 B分离度分别为2．95和5．29，表明方法专属性良好。

耐用性考察：微调流速、柱温、流动相配比及更换色谱柱的色谱条件，考察色谱条件改变对分离度的影响。当色谱条件有微小变化时，主峰与前后杂质峰分离度大于1．5，均符合系统适用性要求，耐用性良好（表2）。

线性关系考察：称取样品30．05mg，精密称定，置50mL容量瓶中，加50%乙腈稀释至刻度，摇匀即得样品溶液。精密量取对照品贮备液 0．5，1．5，2．5，5．0，7．5 mL，分别置10mL容量瓶中，加50%乙腈稀释至刻度，摇匀，即得1－5号线性溶液。精密量取各质量浓度线性溶液10μL注入液相色谱仪，记录色谱图，测定峰面积，以质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标进行线性回归，得回归方程 Y＝17202X－29．492，R2＝0．9989（n＝5）。结果表明，替格瑞洛质量浓度在 0．03005～0．45075 g／L范围内与峰面积线性关系良好。

图2 系统适用性试验高效液相色谱图

表2 耐用性试验结果

检测限与定量限确定：取1号线性溶液，经逐级稀释，配制成系列质量浓度的溶液，精密量取10μL分别进样，当峰高（S）约为基线噪音（N）的3倍时的进样量定为检测限，S／N≈10时的进样量定为定量限，结果分别 0．3005 ng 和 1．2000 ng。

重复性试验：取替格瑞洛样品6份，按样品测定方法操作，计算含量。结果相对百分含量均值为98．78%，RSD为0．10%(n＝6)，小于5%，表明方法重复性良好。

中间精密度试验：换另一操作人员，取替格瑞洛样品6份，按样品测定方法操作，计算含量。结果相对百分含量均值为 98．72% ， RSD 为 0．21%(n＝6)，小于5%，表明方法中间精密度良好。

回收率试验：称取替格瑞洛样品60．32mg，精密称定，置20m L容量瓶中，加50%乙腈稀释至刻度，摇匀，即得供试品贮备液。称取替格瑞洛对照品60．22mg，精密称定，置20m L容量瓶中，加50%乙腈稀释至刻度，摇匀，即得对照品贮备液。精密量取供试品贮备液1m L，置20 m L容量瓶中，加50%乙腈稀释至刻度，摇匀，平行配置3组，作为50%点的溶液。精密量取供试品贮备液3份，各 1 mL，分别置 3个 20 m L容量瓶中，向3个容量瓶中精密移取3份各0．6 mL对照品贮备液，加50%乙腈稀释至刻度，摇匀，作为80%点的溶液。分别精密量取供试品贮备液3份各1m L，对照品贮备液3份各1m L，分别置3组20mL容量瓶中，加50%乙腈稀释至刻度，摇匀，即为100%点的溶液。分别精密量取供试品贮备液3份各1mL，分别置3组20mL容量瓶中，分别再向3组容量瓶中精密移取3份各1．4m L对照品贮备液，加50%乙腈稀释至刻度，摇匀，作为120%点的溶液。精密量取对照品贮备液2．0m L各2份，分别置2组20mL容量瓶中，加50%乙腈稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。回收率试验结果见表3。回收率范围在98．32% ～100．86% 之 间 的 RSD ＝0．95% ， 98% ～102%[15]之间的 RSD≤2．0%，表明准确度良好。

表3 回收率验证结果表

3 讨论

替格瑞洛作为首个可逆性P2Y12受体抑制剂，有更快、更强和更稳定的血小板抑制作用，并能有效降低ACS患者的死亡率。抑制作用可逆是其最大特点，决定了替格瑞洛具有良好的市场前景。但关于其原料药的含量检测方法，目前文献报道较少。为满足产品上市，对含量的测定方法进行研究。本研究中选择了替格瑞洛常含的杂质A和杂质B作为研究对象，考虑到两种杂质的化学结构和替格瑞洛的相似度非常高（参见表1中杂质A、杂质B和替格瑞洛的化学结构式），理化性质很相似，在分析方法学开发中，常难以有效分离，是含量方法学研究中的主要难点。故本研究中以分离的杂质A和杂质B作为主要杂质研究对象，探索它们与替格瑞洛的分离。

本研究中尝试了不同的流动相体系，最终选择乙腈与水的体系。经乙腈与水不同比例的等度洗脱以及梯度洗脱方式试验，结果乙腈起始比例低于30%时，基线波动均较大，影响检测结果的准确性；比例高于30%，梯度缓和，可达到理想的分离效果，但主峰保留时间较长；用等度洗脱且乙腈与水的比例为50∶50时，既可满足分离效果达到要求，同时检测时间最短，操作也较为简单。经过方法验证，结果显示，进样精密度、专属性满足要求，在改变流速和流动相比例后耐用性也符合要求，特别是在更换目前常用的不同品牌的色谱柱后，耐用性也符合要求，证明方法通用性好，对色谱柱的依赖性小；重复性、中间精密度、回收率均符合要求。综上所述，本方法可以用于替格瑞洛原料药的含量测定，进而对该产品的质量进行控制。

研究所建立的方法的优势在于，保证替格瑞洛含量能准确测定的同时兼顾经济性与时效性，对色谱柱的要求不高，能用多种品牌的色谱柱检测，均可达到检测目的。另外，该方法检测时间短，在提高检测效率的同时减少了色谱溶剂的使用量，节约了试验药品的成本。

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Content Determination of Ticagrelor by HPLC

Guo Pan1， Lü Jiuan2， Zhang Kejun2， Zhang Kai1， Peng Xiaoming1， Chao Jianping1
（1．Beijing Institute of Petrochemical Technology， Beijing， China 102600； 2．Beijing Honghui Meditech Co．， Ltd．， Beijing， China 102600）

Objective To establish an HPLC method for content determination of Ticagrelor．Methods The Agilent ZORBAX SB－C18column（250 mm ×46 mm，5 μm） was adopted，the mobile phase was acetonitrile－water （50 ∶50），the detection wavelength was 254 nm，the column temperature was 35 ℃ ，and the flow rate was 1．0 mL ／min．Results The resolutions between the main peak and the front and back impurity peaks were 2．95 and 5．29，the RSD of sample precision was 0．07% ．When the chromatographic conditions change slightly，the resolutions between the main peak and the front and back impurity peaks were more than 1．5．The linear range of mass concentration was 0．03005－0．45075 g／L，and the linear regression equation was Y＝17202 X－29．492，R2＝ 0．9989．The RSD of the repeatability test was 0．10% ，and the RSD of the intermediate precision test was 0．21% ，the recovery rate was in the range of 98．32%－100．86% ， RSD ＝0．95%．Conclusion The method is simple，accurate and reproducible，which can be used to control the content of the active pharmaceutical ingredient（API） of Ticagrelor．

HPLC；ticagrelor；active pharmaceutical ingredient；content determination

R917；R973＋．2

A

1006－4931(2017)24－0019－04

10．3969 ／j．issn．1006－4931．2017．24．006

国家青年科学基金资助项目[21406015]。

郭盼（1992－），女，大学本科，主要从事药物分析工作，（电子信箱）guopan＠ bipt．edu．cn。

晁建平（1963－），男，副教授，研究方向为药物合成与质量，（电子信箱）chaojp＠ bipt．edu．cn。

2017－04－10；

2017－09－03)