星点设计-效应面法优选穿山龙咀嚼片提取工艺

方芳，宋小雪，顾媛媛，郭玉岩，姚丽琴，田明*，高士平，贾永囡,郑文韬

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

制剂工艺

星点设计-效应面法优选穿山龙咀嚼片提取工艺

方芳1，宋小雪1，顾媛媛1，郭玉岩1，姚丽琴1，田明1*，高士平1，贾永囡1,郑文韬2

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

目的：星点设计-效应面法优选穿山龙咀嚼片提取工艺。方法：以乙醇浓度、提取时间、溶媒比为自变量，以薯蓣皂苷含量为因变量，通过对自变量各水平的多元线性回归及二项式拟合，用效应面法选取出最佳工艺，并进行预测分析。结果：确定最优提取工艺为8倍量，80%乙醇，提取2次，每次120 min，提取预测值与理论值偏差平均值为1.4%，二项式拟合复相关系数0.976 9。结论：星点设计-效应面法优选的穿山龙咀嚼片提取工艺方法简单，精密度高，可预测性较好。

穿山龙咀嚼片；星点设计；提取工艺

穿山龙为薯蓣科蓣薯属植物穿龙薯蓣(DioscoreanipponicaMakino)的根茎，味甘、苦，性温，归肝、肾、肺经[1],主要在我国东三省、内蒙古等地分布[2]。现代已作为甾体激素药物和抗冠心病皂苷类药物的重要工业原料[3]。现代药理研究表明，其总皂苷类成分具有调节免疫、降血糖、改善心血管功能、抗炎镇痛等多种药理作用[4-6]。本文采用星点设计效应面法，优选穿山龙药材的乙醇提取条件，为穿山龙咀嚼片制剂提取工艺提供生产依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪(ThermoU3000，美国Thermo公司；KQ-300V型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；循环水式多用真空泵(SHB-ⅢA郑州长城科技工贸有限公司)；电热恒温水浴锅(BC1，北京中西集团公司)；电热恒温干燥箱(DNP-9052，上海精宏实验设备有限公司)；电子天平(JD1000-2，沈阳龙腾电子称量仪器有限公司);旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂，RE-52A)。

1.2 试药

穿山龙(哈药集团世一堂中药饮片厂)；标准品薯蓣皂苷(北京世纪奥科生物技术有限公司，批号16062，供含量测定用)；乙醇为分析纯，甲醇和乙腈为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 穿山龙薯蓣皂苷含量测定

2.1.1 色谱条件与系统适应性研究

色谱柱：AcclaimTM120 C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；以乙腈-水(55∶45)为流动相；检测波长为203 nm；流速为1.0 ml/min；柱温：25℃；理论塔板数按薯蓣皂苷峰计算应不低于2 000[3]。

2.1.2 对照品溶液的制备

取薯蓣皂苷对照品,精密称定,加甲醇制成0.301 2 mg/mL的对照品溶液。

2.1.3 标准曲线的制备

分别精密量吸取上述对照品溶液2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、12 μL、14 μL注入液相色谱仪中，测定。以含量为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得线性方程为：Y=3.863 8X-0.023 1，R2=0.999 9。结果表明薯蓣皂苷含量在0.612 4 μg～4.216 8 μg的范围内与峰面积线性关系良好。见图1。

图1 薯蓣皂苷标准曲线

2.2 穿山龙提取工艺优化

2.2.1 实验方法及星点试验设计

取穿山龙生药30 g，按照星点试验设计安排实验，得到20次实验的提取液，分别将提取液适当浓缩，加乙醇定容于100 mL容量瓶中。精密量取1 mL于蒸发皿中，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解，滤过，定量转移置10 mL容量瓶中，用于测定薯蓣皂苷含量。

考察因素为乙醇浓度、提取次数、提取时间和加醇量，因提取次数为非连续变量，回归处理比较困难，结合工业生产的实际，暂固定为2次，其余因素的水平根据预实验的结果而定。根据星点设计的原理，每因素设5个水平，用代码-α、-1、0、1、α来表示。代码值所代表的实际操作物理量见表1，实验安排与结果见表2。

表1 穿山龙提取工艺优化星点试验因素水平

表2 穿山龙提取工艺星点试验设计与结果

2.2.2 模型拟合

以薯蓣皂苷含量为因变量，运用统计分析软件Design-Expert 8.0以各因变量分别对自变量进行多元线性回归、二项式拟合，并以相关系数(r)和置信度(P)为模型判定标准，选择有较大 r 值和较优P 值对方程进行优化，得多元线性回归方程：Y=7.76+0.17X1+3.22X2+0.49X3(R2=0.877 0,P<0.000 1)；二项式方程：Y=8.90+0.17X1+3.22X2+0.49X3+0.60X1X2+0.084X1X3+0.091X2X3-0.86X12-0.34X22-0.47X32(R2=0.976 9，P<0.000 1)。多元线性回归复相关系数较低，表示模型拟合度不高，自变量与因变量间线性相关性较差，所以不宜用线性模型，而二项式回归方程复相关系数较高，表明具体实验因素对效应值的影响不是简单的线性关系。最后选择多元二项式拟合模型为成功模型，实测值和预测值基本吻合，有较好的预测作用。

2.2.3 效应面优化与预测

根据优化后的二项式方程，运用 Design-Expert 8 软件作三维效应面图，见图2～4。由效应面图2～4可知，选择效应面图上薯蓣皂苷含量大的区域，可求得提取工艺的最佳工艺参数，即当乙醇浓度在70%

图2 乙醇浓度和提取时间对薯蓣皂苷含量的影响

图3 乙醇浓度和加醇量对薯蓣皂苷含量的影响

图4 提取时间和加醇量对薯蓣皂苷含量的影响

2.2.4 验证试验与结果

称取10倍量(300 g)药材，共3份。 按最佳工艺回流提取，分别合并提取液，取提取液的1/10浓缩定容至100 ml量瓶中，按2.2.1项下方法测定薯蓣皂苷含量。结果分别为11.945 6、11.995 8、12.035 9,验证试验结果与方程预测值比较，相对偏差[相对偏差=(预测值-实测值)/预测值]分别为1.7%、1.4%、1.0%，平均值约为1.4%。偏差都较小，表明所建立的数学模型具有良好的预测性，所选的条件重复性良好，证明该工艺可靠可行。

3 讨论

穿山龙药材主要含有甾体皂苷类化合物，薯蓣皂苷属于难溶于水的甾体化合物，也是主要有效成分，以其为测定指标考察醇提取工艺参数，具有代表性[7-10]。本试验采用了星点设计-效应面法对穿山龙提取工艺进行了优化，设计方法简单，试验次数少，充分考虑到各因素的交互作用，在中心点进行重复试验以提高试验精度，同时采用了二项式回归方程，相关系数及置信度均较好，预测值与试验真实值接近，更符合实际，节约能源，提高了效率，结果稳定、可靠，为下一步制剂成型工艺研究奠定了基础。

[1] 张宁,于栋华,周琦,等.穿山龙药理研究作用的研究进展[J].中国药房,2015,26(4):547.

[2] 贾晓晴，尹海波，陶玲，等.不同产地穿山龙活性成分与环境因子相关性研究[J].辽宁中医杂志,2017,44(4):820-824.

[3] 中国药材公司.中国中药资源志要[M].北京:科学出版社,1994:1414.

[4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:中国医药科技出版社,2015:267-268.

[5] 方芳，顾媛媛，郭玉岩，等.穿山龙降糖制剂的降糖药理作用研究[J].中医药学报，2017,45(4):33-36.

[6] 刘树民，张宁，周琦，等.药理效应法测定穿山龙总皂苷的药动学参数[J].中国实验方剂学杂志，2016,22(16):76.

[7] 郭帅.穿山龙中薯蓣皂苷元衍生物的合成及体外活性筛选[D].长春：吉林农业大学,2016:9-18.

[8] 冯冰.甾体皂苷生物转化及其特异性糖苷酶的研究[D].北京：中国人民解放军军事医学科学院，2005:12-13.

[9] 胡湘春，鱼红闪，金凤燮.穿山龙薯蓣皂苷的分离提纯[J].大连轻工业学院学报，2004,23(1):25-29.

[10] 张小飞，刘洁琼.大孔树脂分离纯化穿山龙薯蓣皂苷工艺实验研究[J].中南药学，2012，10(5)：321.

OptimalExtractionProcessofDioscoreanipponicaMakinoTabletsbyCentralCompositeDesignResponseSurfaceMethod

FANG Fang1, SONG Xiao-xue1, GU Yuan-yuan1, GUO Yu-yan1, YAO Li-qin1, TIAN Ming1, GAO Shi-ping1, JIA Yong-nan1, ZHENG Wen-tao2

(1.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China;2.TheFiratAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)

Objective: To optimize the extraction process ofDioscoreanipponicaMakinotablets by central composite design response surface method(ccd-rsm). Methods: Ethanol concentration, extraction time, solvent ratio were taken as independent variables with diosgenin content as dependent variable, through multiple linear regression and binomial fitting each level of independent variables, using the response surface method to select out the best technology, and carried on the forecast analysis. Results: The optimum extraction process was 8 times of 80% ethanol, twice extraction, each time for 120min, and the average deviation between the predicted and theoretical values was 1.4%, and the binomial fitting complex correlation coefficient was 0.976 9. Conclusion: Method of ccd-rsm was used to optimize the extraction process ofDioscoreanipponicaMakinotablets, the method has the characteristic of easiness, high precision, and good predictability.

DioscoreanipponicaMakinotablets; Central composite design; Extraction process

R284.2

A

1002-2406(2017)06-0085-03

2017-07-12

2017-08-10

哈尔滨市科学技术局科技创新人才应用技术研究与开发(青年后备人才)项目(No.2016RQQXJ125)；黑龙江省博士后资助课题(No.LBH-Z16193)

方芳(1980-)，女，助理研究员，博士，博士后，主要从事中医药研究工作。

*通讯作者：田明(1963-)，男，教授，主要研究方向：中药质量标准研究。