针刺不同穴位对寒凝证类痛经大鼠子宫收缩程度及疼痛相关机制的影响

杨佳敏，沈小雨，张玲，罗丽，许咏思，任晓暄，郭孟玮，赵雅芳，申松希，朱世鹏，齐丹丹，嵇波，李晓泓，朱江，张露芬*

(1.北京劳动保障职业学院，北京 100029；2.北京中医药大学针灸推拿学院,北京 100029)

针灸经络

针刺不同穴位对寒凝证类痛经大鼠子宫收缩程度及疼痛相关机制的影响

杨佳敏1，沈小雨2，张玲2，罗丽2，许咏思2，任晓暄2，郭孟玮2，赵雅芳2，申松希2，朱世鹏2，齐丹丹2，嵇波2，李晓泓2，朱江2，张露芬2*

(1.北京劳动保障职业学院，北京 100029；2.北京中医药大学针灸推拿学院,北京 100029)

目的：比较针刺三阴交穴、关元穴对寒凝证类痛经大鼠子宫平滑肌收缩程度及脊髓、子宫组织中κ-受体、μ-受体含量的影响，探讨不同穴位介入的效应差异及部分机制。方法：将64只雌性SD大鼠随机分为盐水组、寒凝证类痛经模型组、针刺三阴交组、针刺关元组，每组16只。采用皮下注射苯甲酸雌二醇和低温冷冻的方法制备寒凝证类痛经模型，末次给药1 h后，麻醉大鼠，运用BL-420F生物机能实验系统记录子宫的收缩程度。采用Real Time-PCR检测大鼠脊髓及子宫组织中κ-受体、μ-受体的含量。结果：1.子宫平滑肌收缩程度：与盐水组比较，模型组子宫收缩波的个数显著增加(P<0.01)、子宫收缩波峰峰值显著升高(P<0.05)、子宫活动度显著增强(P<0.01)，三阴交组、关元组子宫活动度显著增强(P<0.01，P<0.05)；与模型组比较，三阴交组与关元组子宫收缩波的个数及子宫活动度均显著下降(P<0.05)。2.脊髓及子宫组织中κ-受体、μ-受体水平：(1)脊髓中的κ-受体及μ-受体水平：各组间比较无统计学差异；(2)子宫组织中的κ-受体水平：各组间比较无统计学差异；(3)子宫组织中μ-受体水平：与盐水组比较，关元组子宫组织中μ-受体水平显著升高(P<0.05)；与模型组比较，三阴交组、关元组子宫组织中μ-受体水平均显著升高(P<0.05，P<0.01)。结论：针刺三阴交穴、关元穴均可降低子宫收缩波个数和子宫活动度，抑制子宫平滑肌的异常收缩反应。分析其效应的部分机制是通过调节子宫靶器官组织的阿片肽受体水平，进而达到针刺镇痛的作用。

寒凝证类痛经模型；子宫收缩程度；κ受体；μ受体；三阴交穴；关元穴

原发性痛经是妇科常见疾病，以经期或行经前后周期性小腹疼痛或痛引腰骶为主要症状，具有较高的临床发病率。原发性痛经的发病主要是子宫平滑肌的收缩痉挛，局部缺血缺氧引起疼痛，既往很多研究证实了针刺的镇痛效应，且不同经穴效应之间存在一定的差异，本研究拟观察针刺不同经穴对寒凝证类痛经模型大鼠子宫平滑肌收缩程度及疼痛相关物质的影响，探讨经穴间的效应差异及其作用机制，以期为指导临床选穴提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级健康Sprague-Dawley(SD)品系雌性大鼠，3月龄，64只，性成熟未交配，体质量(240±20)g，由北京军事医学科学研究院提供，合格证号,SCXK2007-004(军)。动物置于清洁柜中，喂以大鼠普通饲料，自由饮水，实验室温度保持在(23±1)℃，湿度(45±5)%，标准的12 h昼夜交替(每日早上8点开灯)。实验在白天进行，实验开始前，动物至少适应性饲养1周。本动物实验过程均遵守美国国立卫生院倡导的实验动物关怀、使用指导原则，及以减少、替代和优化为核心的动物实验“3R”原则。

1.2 主要试剂

苯甲酸雌二醇注射液(宁波市三生药业有限公司，批号：120207)；缩宫素注射液(上海禾丰制药厂生产，批号：120302)；自制美兰染色液；氨基甲酸乙酯(批号T20080530)；SYBR Green PCR Master Mix试剂盒(美国应用生物公司，批号：0604226)；琼脂糖(西班牙Biowest公司，批号：051363)。

1.3 主要实验仪器

BC/BD-379HB卧式冰柜(青岛海尔集团)；BL-420F生物机能实验系统(成都泰盟科技有限责任公司)；FT-100 型张力换能器(成都泰盟科技有限责任公司)；MDF-u50A型超低温冰箱(日本三洋公司)；PRISM 7700型荧光定量PCR仪(美国应用生物公司)；DYCP-31D型琼脂糖水平电泳槽(北京市六一仪器厂)；Image master VDS扫描仪(瑞典Pharmacia Biotech 公司)。

1.4 动物分组

通过阴道涂片法，即每日定时用细棉签蘸以等渗盐水，湿润后轻轻插入大鼠阴道约0.5 cm，稍微转动后取出，将带有阴道内容物的棉签在载玻片上均匀转动后涂片，在显微镜下观察阴道涂片的组织学变化，根据细胞形态、种类及数量筛选出处于动情间期的大鼠64只。按照随机数字表法分为盐水组、寒凝证类痛经模型组、针刺三阴交组、针刺关元组，每组16只。

1.5 模型的制备

将阴道涂片法筛选的处于动情间期的大鼠，除盐水组外，其余各组大鼠均皮下注射苯甲酸雌二醇，连续10天，于第1天及第10天皮下注射0.5 mg/只，于第2～9天皮下注射0.2 mg/只，末次给药1 h后，腹腔注射缩宫素2 U/只。造模第1～5天，将大鼠放入-25℃的冰柜中，持续受冻4 h左右，中间间隔2 h，开盖通气5 s。待大鼠出现寒颤停止，畏寒喜暖，蜷缩少动，朦胧欲睡，反应迟钝，呼吸微弱，毛发蓬松、竖立、无光泽，小便色淡，大便湿烂，耳色暗红，爪甲及尾部紫暗、肿胀等症状和体征时，将大鼠取出冰柜。盐水组每日注射同等剂量的生理盐水，不冷冻。

1.6 取穴[1]

三阴交穴：后肢内踝尖直上10 mm处；关元穴：大鼠脐下约25 mm。

1.7 针刺方法

手针操作，使用0.25 mm×40 mm的一次性无菌针灸针(中研太和牌，无锡，中国)。针刺三阴交组直刺入三阴交穴4 mm～5 mm，针刺关元组直刺入关元穴4 mm～5 mm，针刺即刻及针刺10 min时行平补平泻的捻转手法30 s，留针20 min后取针。模型组和盐水组不予针刺处理。

1.8 子宫收缩程度的检测

于造模第10天，注射苯甲酸雌二醇后，肌肉注射20%氨基甲酸乙脂溶液麻醉大鼠，手术切开腹部，寻找“Y”型子宫，在一侧子宫，于子宫角分叉上1 cm处将钩横穿子宫肌层，线的另一端连接于张力传感器上，加0.1 g负荷，采用BL-420F生物机能实验系统记录子宫的收缩程度，首先记录其在5 min内的基础波形，然后将缩宫素滴在子宫上，标记这一时间点，10 min后，施以平补平泻的捻转手法30 s，标记此时间点，再留针10 min，标记时间点，取针，停止记录。记录子宫收缩波个数、子宫收缩波峰峰值以及子宫活动度(子宫收缩波个数×峰峰值)。

1.9 Real Time-PCR检测脊髓及子宫中κ-受体、μ-受体

本实验采用去冠法处死大鼠，在冰盘上迅速取下大鼠的子宫及脊髓(剥离周围附属组织)，经液氮迅速降温后移至超低温冰箱中保存待测。

根据NCBI数据库中的κ阿片受体、μ阿片受体基因序列，以Primer Premier 5.0软件设计引物，由北京赛百盛基因技术有限公司合成(κ受体引物上游5′-CTGACGCTGATTTGGGAAGG-3′，下游5′-AGCACTGGGAGCACAGGTAG-3′，产物长度151 bp；μ受体引物上游5′-GAACATCCCTCCACGGCTAA-3′，下游5′-TGCACGCGATTTCAAAGACC-3′，产物长度177 bp；内参β-actin上游5′-AATCGTGCGTGACATTAAAGAG-3′，下游5′-CATTGCCGATAGTGATGACCT-3′，产物长度137 bp)。在ABI的PRISM 7700型荧光定量PCR仪进行实时定量PCR反应，按以下反应体系进行：20 μL PCR反应体系中含2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，cDNA 2 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL。扩增条件为95℃ 3 min变性，94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min；共40个循环，最后是72℃ 7 min延伸。反应结束后，根据测得的样品CT值，以2-△△CT表示目的基因的相对值。

1.10 数据处理及统计学分析

采用SPSS17.0软件包进行统计分析，若各组均正态且方差齐，采用One-Way ANOVA分析，继以LSD进行多组间比较；若各组均正态而方差不齐，采用Welch检验；若各组不服从正态性检验，则采用非参数检验，继以两两组间比较。以P<0.05为差异具有统计学意义的标准。

2 结果

2.1 针刺不同穴位对寒凝证类痛经模型大鼠子宫收缩程度的影响

2.1.1 各组间子宫收缩波个数的比较

与盐水组比较，模型组收缩波个数显著增加(P<0.01)；与模型组比较，三阴交组及关元组收缩波个数均显著下降(P<0.05),见表1。

2.1.2 各组间子宫收缩波幅度的比较

与盐水组比较，模型组子宫收缩波变化幅度(峰峰值)显著升高(P<0.05),见表1。

2.1.3 各组间子宫活动度的比较

与盐水组比较，模型组、三阴交组、关元组子宫活动度(收缩波个数×峰峰值)均显著增加(P<0.01，P<0.05)，与模型组比较，三阴交组、关元组子宫活动度均显著下降(P<0.05),见表1。

表1 针刺不同穴位对寒凝证类痛经大鼠模型子宫收缩程度的影响

注：与盐水组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与模型组比较，▲P<0.05

2.2 针刺不同穴位对寒凝证类痛经模型大鼠脊髓及子宫组织中κ-受体、μ-受体水平的影响

2.2.1 各组间脊髓组织中κ-受体、μ-受体水平的比较

各组间比较，脊髓组织中κ-受体、μ-受体水平均无显著性差异,见表2。

表2 针刺不同穴位对寒凝证类痛经大鼠脊髓组织中κ-受体、μ-受体水平的影响

2.2.2 各组间子宫组织中κ-受体水平的比较

各组间比较，子宫组织中κ-受体水平无显著性差异,见表3。

2.2.3 各组间子宫组织中μ-受体水平的比较

与盐水组比较，关元组子宫中μ-受体水平显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，三阴交组、关元组子宫组织中μ-受体水平显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，见表3。

表3 针刺不同穴位对寒凝证类痛经大鼠子宫组织中κ-受体、μ-受体水平的影响

注：与盐水组比较，△P<0.05；与模型组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01

3 讨论

本研究采用低温冰柜冷冻的方法制备寒凝证动物模型，在此基础上基于苯甲酸雌二醇可以增强子宫活动度，提高子宫平滑肌对缩宫素的敏感性，而缩宫素可使子宫平滑肌收缩，引起疼痛，从而运用苯甲酸雌二醇和缩宫素联合的方法来制备类痛经大鼠模型，符合人类原发性痛经的发病机制，本研究对寒凝证动物模型制备方法进行中医证型的综合评价后，将寒凝证模型制备方法与类痛经模型制备方法相结合制备寒凝证类痛经大鼠模型。[2-7]

中医学认为，穴位乃是“神气之所游行出入”之处，它外络肢节，内属脏腑，是人体脏腑、经络之气输注于体表的部位。穴位作为一个感受装置，在针刺作用下，通过相应的神经通路，引起各种相应的机能活动，同时穴位又作为一个效应装置，在神经、体液或内脏活动的影响下，表现出某些机能或理化特性，即经穴-脏腑相关性[8]。卜彦青等[9]对近十年关于针灸治疗原发性痛经的穴位使用频次进行统计，发现使用频次最多的前十位依次是三阴交、关元、足三里、气海、中极、地机、太冲、次髎、肾俞、血海。故本研究选取临床治疗原发性痛经最常用的两个穴位-三阴交穴和关元穴，并通过检测子宫平滑肌的收缩程度，脊髓和子宫组织中κ-受体、μ-受体的水平，观察不同经脉的腧穴效应是否存在差异，进而探讨产生其效应的部分生物学机制。

本研究结果显示，模型组大鼠子宫平滑肌收缩波的个数、子宫收缩变化幅度以及子宫活动度均显著增加，证明寒凝证类痛经模型大鼠子宫平滑肌收缩紊乱，而针刺三阴交穴、关元穴均可明显抑制寒凝证类痛经模型大鼠的子宫平滑肌痉挛性收缩。研究结果显示三阴交穴、关元穴均具有对大鼠子宫平滑肌的调节效应，进而达到止痛的作用。

相关研究报道证实阿片肽及其受体不仅广泛的分布在中枢神经系统(脑、脊髓)中，在外周组织中也有分布，大鼠子宫平滑肌上分布着μ、δ受体，而以前者为主。外源性阿片类物质对子宫平滑肌的影响随性周期而变化，吗啡对妊娠子宫平滑肌收缩无影响，而高于临床用药剂量时，阿片类药物可直接作用于子宫平滑肌，抑制平滑肌的收缩[10]。

本研究采用低温冷冻的方法及药物制备寒凝证类痛经大鼠模型，首先，苯甲酸雌二醇及缩宫素的刺激可引起子宫局部的炎症反应；其次，大鼠受到寒冷的刺激，使炎症局部释放β-内啡肽，作用于局部组织的μ受体，因此局部靶器官保护性应激反应明显，针刺介入后进一步大量激活局部靶器官组织中的镇痛物质而发挥止痛作用，因此局部组织中μ-受体水平的变化，更直观证实了针刺的调节效应。

本实验结果显示针刺三阴交穴、关元穴均使子宫中μ-受体水平显著升高，而κ-受体水平未见明显变化，说明针刺可激活μ阿片受体，与内源性阿片肽结合。因此，μ阿片肽受体在子宫中有显著变化，而在中枢中未见明显变化，可能与针刺的时间效应有一定的关系，今后的研究中有待进一步观察。

综上所述，针刺三阴交穴、关元穴后，可缓解寒凝证类痛经模型大鼠的子宫平滑肌的异常收缩状态，其效应机制是通过调节子宫靶器官组织的阿片肽受体水平，进而达到针刺镇痛的作用。

[1] 张露芬.实验针灸学[M].北京：化学工业出版社,2010：219-220.

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[3] 张玲，申松希，朱世鹏，等.寒凝证动物模型的建立[J].山东中医药大学学报，2013,37(3)：248-250.

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[5] 杨佳敏，沈小雨，罗丽，等.针刺不同穴位对寒凝证类痛经大鼠体表区域温度的影响[J].医学研究生学报，2014，27(9)：900-904.

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EffectandtheMechanismofAcupunctureatDifferentAcupointsfortheUterusContractionsinDysmenorrheaRatswithColdCongealing

YANG Jia-min1, SHEN Xiao-yu2, ZHANG Ling2, LUO Li2, XU Yong-si2, REN Xiao-xuan2, GUO Meng-wei2, ZHAO Ya-fang2, SHEN Song-xi2, ZHU Shi-peng2, QI Dan-dan2, JI bo2, LI Xiao-hong2, ZHU Jiang2, ZHANG Lu-fen2

(1.BeijingVocationalCollegeofLabourandSocialSecurity,Beijing100029,China;2.CollegeofAcupunctureandTuina,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)

Objective: To compare the different effect of needling SP6 and CV4 on dysmenorrhea rats of cold congealing type, by observing the uterus contraction level, and the changes of κ opioid receptor and μ opioid receptor in the spinal cord and uterus tissues. Methods: 64 female SD rats were randomly divided into the saline control group, the model group, SP6 group (needling acupoint SP6), and CV4 group(needling acupoint CV4), with 16 rats in each group. The models were established by subcutaneously injecting Estradiol Benzoate and being exposed to freezing environment. One hour later after the injection of Estradiol Benzoate on the 10th day, 0.7 ml/100 g Urethane was given by intramuscular injection for anesthesia. BL-420F was used to record the uterus contraction. Real Time - PCR was applied to test the amount of κ opioid receptor and μ opioid receptor in the spinal cord and uterus tissues. Results: In terms of uterine contraction: compared to saline control group, the amount of the uterine contraction waves, peak wave values, and uterine activities were increased significantly in the model group, group SP6, and group CV4(P<0.05 orP<0.01); in which the needling groups improved significantly compared to the model group(P<0.05 orP<0.01). In terms of the changes of κ opioid receptor and μ opioid receptor, there was no significant difference on κ and μ opioid receptors in the spinal cord among the four groups; There was no significant difference on the κ opioid receptor in the uterus among the groups; compared to the saline control group, μ opioid receptor in the uterus increased significantly in group CV4 (P<0.05); compared to the model group, μ opioid receptor in the uterus increased significantly in both group SP6 and group CV4(P<0.05 orP<0.01). Conclusion: Needling on SP6 and CV4 can both reduce the amount of uterus contraction waves and contraction degree to alleviate abnormal uterus contraction. The mechanism may be achieved by regulating the endogenous opioid receptor in uterus tissues.

Dysmenorrhea model of cold congealing type; Uterus contraction degree; κ opioid receptor; μ opioid receptor; SP6; CV4

R245.2;R271.11+3

A

1002-2392(2017)06-0073-04

2017-03-08

2017-07-10

国家重点基础研究发展计划(973计划)(No.2012CB518506)；国家中医药管理局针灸生物学三级实验室

杨佳敏(1987-)，女，博士研究生，研究方向：针灸的神经生物学机制研究。

*通讯作者：张露芬(1953-)，女，教授，博士研究生导师，研究方向：针灸的神经生物学机制研究。