基于TLR4信号通路探讨豨莶草对痛风性关节炎影响

徐轶尔，于雪峰，陈水林，韩忠丽，孙贵才*

(1.哈药集团药物研究院，黑龙江 哈尔滨 150025；2.南昌大学第四附属医院，江西 南昌 330003；3哈尔滨医科大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150086)

实验研究

基于TLR4信号通路探讨豨莶草对痛风性关节炎影响

徐轶尔1，于雪峰2，陈水林2，韩忠丽3，孙贵才2*

(1.哈药集团药物研究院，黑龙江 哈尔滨 150025；2.南昌大学第四附属医院，江西 南昌 330003；3哈尔滨医科大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150086)

目的:基于TLR4信号通路探讨豨莶草对痛风性关节炎影响。方法: 将48只SD大鼠随机分为对照组、模型组、秋水仙碱组和豨莶草高(4 g/kg)、中(2 g/kg)、低(1 g/kg)组，对照组和模型组灌胃给予生理盐水，其他各组给予相应的药物，连续7天，第七天给药1 h后向大鼠膝关节腔注射尿酸钠，建立痛风性关节炎模型，对照组不做处理，采用HE染色观察滑膜组织病理情况，ELISA检测大鼠血清中TNF-α，IL-1和IL-8含量，RT-PCR测定MyD88,TRAF6,TBK1和NFκBmRNA表达。结果:与对照组比较，模型组炎性细胞浸润，滑膜细胞增生，成纤维细胞，不同浓度豨莶草组对滑膜组织炎性细胞浸润明显减少，滑膜细胞增生和成纤维细胞增生明显减轻；模型组大鼠血清中TNF-α，IL-1和IL-8含量明显增高，不同浓度豨莶草组血清中TNF-α，IL-1和IL-8含量明显降低；RT-PCR结果显示模型组滑膜组织MyD88、TRAF6、TBK1和NF-κB mRNA表达明显增加，不同浓度豨莶草组能够明显降低痛风性关节炎大鼠MyD88、TRAF6、TBK1和NF-κB mRNA表达。结论:豨莶草能够明显改善痛风性关节炎症状，抑制TLR4信号通路异常激活。

豨莶草；痛风性关节炎；TLR4;MyD88;TRAF6;NF-κB

痛风性关节炎(gouty arthritis，GA)是由于血液中尿酸增高，尿酸盐结晶析出，沉积在滑膜、软骨、关节囊和骨质等关节组织，引起关节滑膜及周围组织病理性损伤和炎症反应[1]。随着人们饮食结构和生活方式的变化，痛风患者的比例逐年上升，致残率和致畸率较高，给人们的生活和健康带来不便。目前尚无确切的治疗方法根治GA，现在主要的治疗目的就是及时控制急性发作，并减低血液中尿酸，减少尿酸盐沉积，降低关节损伤等，临床上痛风性关节炎急性发作常用秋水仙碱治疗，然而秋水仙碱可导致严重的肝脏、肾脏和骨髓的损伤[2-3]。因此，寻找一种低毒、高效的治疗药物，仍是GA治疗应该急需解决的关键问题。

豨莶草味辛、苦、寒，具有祛风湿、利关节和解毒之功效，主要用于治疗风湿痹症，关节疼痛，筋骨无力，腰膝酸软等[4]。我们前期研究发现以豨莶草为主药的复方豨莶草胶囊能够明显降低痛风性关节炎模型大鼠血清中IL-1β和IL-6水平、明显降低炎性因子的释放，降低NF-κB的转录，明显改善痛风性关节炎症状[5-6]。近年来发现Toll样受体是一类新的细胞表面信号传导跨膜受体，Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)是先天性和后天获得性免疫的桥梁，在免疫系统的调节中有着十分重要的作用[7-8]。TLR4及其相关配体激活后，能够通过MYD88依赖型途径和MYD88非依赖型途径激活核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)，从而表达大量的炎症细胞因子和化学因子，从而加重对组织器官的损伤[9]。因此，本实验以TLR4信号通路为基础，探讨痛风性关节炎的发生发展与TLR4信号通路之间的关系及中药豨莶草干预机制影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料与动物

豨莶草购于哈尔滨市同仁堂大药房；秋水仙碱和尿酸钠(Uric acid sodium salt，U2875-5G) 购自美国Sigma 公司；大鼠白细胞介素IL-1、白细胞介素IL-8和肿瘤坏死因子TNF-α酶联免疫试剂盒购于美国R&D公司； PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成；清洁级健康雄性Wistar大鼠36只，由哈尔滨医科大学动物实验中心提供，体质量(180～200)g，动物合格证号：SCXK(黑)2015-001。实验动物饲料由黑龙江中医药大学动物实验中心提供，饮用水为清洁自来水，实验室温度为18～25℃，相对湿度为40%～75%，自然光照，保持垫料干燥。常规适应性喂养14天后再进行试验。

1.2 豨莶草提取物制备

将豨莶草药材40℃烘干，粉碎成干粉，然后加入10倍水于80℃提取两次，每次提取30 min。过滤，弃去滤渣，合并滤液，过滤，将溶液浓缩至100 mL，离心2 000 r/min ，10 min，取上清液，备用。

1.3 痛风性关节炎模型建立及分组

将雄性SD大鼠随机分为对照组、模型组、秋水仙碱组和豨莶草高(4 g/kg)、中(2 g/kg)、低(1 g/kg)组，各组6只分别给予生理盐水或药物7天，末次给药1 h后，大鼠膝关节腔注射尿酸钠0.2 mL(20 mg/mL)，对照组膝关节腔注射生理盐水0.2 mL。

1.4 滑膜组织形态学检测

取各组大鼠滑膜组织，4%多聚甲醛固定,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,浸蜡,石蜡包埋切片,二甲苯进行脱蜡，梯度浓度的乙醇进行水化，Harris苏木精染色3～5 min，蒸馏水冲洗1 min，75%盐酸乙醇分化数秒钟，蒸馏水冲洗10 min至细胞核呈蓝色，0.5%伊红水溶液1 min，梯度浓度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察并拍照。

1.5 痛风性关节炎大鼠血清中TNF-α，IL-1和IL-8含量测定

采集各组大鼠腹主动脉血液，3 500 r/min，离心15 min，收集血清，按照ELISA试剂盒说明书要求测定TNF-α，IL-1和IL-8含量。

1.6 实时PCR检测滑膜组织中MyD88、TRAF6、TBK1和NF-κB mRNA表达

MyD88、TRAF6、TBK1和NF-κB mRNA引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列：NFκB上游5′-CCCATGTAGACAGCACCACCTATGAT-3′，下游5′-ACAGAGGCTCAAAGTTCTCCACCA-3′，MyD88上游5′-GCTGT AGG GGGAATGTGTGT-3′，下游5′-GGCTCTGGTTTC CACTGTCC-3′，TRAF6 上游5′-GGGAACGATACGCCTTACAA-3′，下游5′-CTCTGTCTTAG GGCGT CCAG-3′，TBK1上游5′-ACAGATTTTGGTGCAGCCAG-3′，下游5′-CCTTAT TCCTACGTGGCCCT-3′，GAPDH上游5′-GGAGAACGGGA AGC TTGTCA-3′，下游5′-GCCTTCTCC AT GGTCGTGAA-3′。取各组滑膜组织100 mg，按TRIZOL法提取总RNA，并按照逆转录试剂盒说明将提取的总mRNA逆转录成cDNA，并应用cDNA用于实时定量PCR检测。

1.7 统计分析

2 结果

2.1 病理学观察

在显微镜下观察，对照组滑膜细胞间彼此排列疏松，滑膜细胞之间为胶原性间质，无炎性细胞浸润；模型组炎症明显，炎性细胞浸润，滑膜细胞增生，成纤维细胞及小血管增生, 纤维炎性蛋白渗出物；秋水仙碱组和豨莶草高、中、低组炎性细胞浸润明显减少，滑膜细胞增生和成纤维细胞增生明显减轻，且豨莶草对滑膜组织的炎症影响呈剂量依赖性(见图1)。

2.2 大鼠血清中TNF-α，IL-1和IL-8含量测定

与对照组比较，模型组痛风性关节炎大鼠血清中炎性因子TNF-α，IL-1和IL-8含量明显增加(P<0.05)；与模型组比较，秋水仙碱组和豨莶草高、中、低组痛风性关节炎大鼠血清中炎性因子TNF-α，IL-1和IL-8含量明显降低(P<0.05)，而且秋水仙碱组和豨莶草高剂量组相关血清中炎性因子浓度降低显著高于中低剂量组。说明豨莶草的剂量增加抑制炎性因子的释放明显(见表1)。

表1 大鼠血清中IL-1、IL-8和TNF-α含量

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05;与秋水仙碱组比较，△P<0.05

2.3 滑膜组织中MyD88、TRAF6、TBK1和NF-κB mRNA表达

如表2所示，与对照组比较，模型组滑膜组织中MyD88、TRAF6、TBK1和NF-κB mRNA表达明显升高(P<0.05)；与模型组比较，秋水仙碱组和豨莶草高、中、低组滑膜组织中MyD88、TRAF6、TBK1和NF-κB mRNA表达降低(P<0.05)，且秋水仙碱组和豨莶草高剂量组滑膜相关mRNA表达降低显著高于中低剂量组。在一定剂量范围内豨莶草对滑膜组织中MyD88、TRAF6、TBK1和NF-κB mRNA表达呈正相关。

表2 痛风性关节炎滑膜组织中MyD88、TRAF6、TBK1和NF-κB mRNA表达

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与秋水仙碱组比较，△P<0.05

3 讨论

Toll样受体是启动天然免疫的一类古老的细胞表面信号传导跨膜受体蛋白，在防御病原微生物的信号转导通路中发挥着重要的作用，连接天然免疫和获得性免疫的关键，在疾病的防治和维护健康起着关键作用。TLR4是天然免疫系统识别病原体的主要受体，是抗原呈递识别病原体，启动获得性免疫反应的桥梁[10-11]。TLR4在免疫细胞、上皮细胞和内皮细胞均大量表达，是天然免疫的人体第一道防线，与慢性炎症、自身免疫病、肿瘤和细菌性疾病有关。TLR4低表达不能产生免疫反应，不能够清除外源性致病物质，引起疾病，TLR4过表达则导致免疫系统失调性疾病，如风湿性关节炎[12]。TLR4被激活能够通过MyD88依赖和非依赖两条胞内信号转导途径作用于炎症基因和干扰素诱导基因的转录, MyD88依赖途径是TLRs家族的共同通路，同时也是其主要的信号转导途径。TLR4被激活后，募集MyD88蛋白，激活TRAF-6、 IKK和NF-κB，进而启动炎症细胞因子的分泌和产生；另一部分对于MyD88非依赖途径募集TRIF，激活TRAF-6和TBK1，进而激活NF-κB，启动NF-κB的后期基因转录，产生和分泌白介素和干扰素等[13]，因此，TLR4成为临床疾病治疗和预防的关键靶点，调控相关疾病的发生和发展。

痛风性关节炎的发病机制复杂，研究证实痛风性关节炎的发生发展与炎性因子IL-1、IL-8和TNF-α释放及其相关信号通路激活，抗原呈递细胞活化，中性粒细胞凋亡和免疫球蛋白等有关[14]。因此，本研究以TRL4为关键点研究痛风性关节炎发病机制，研究发现痛风性关节炎模型组中大鼠血清中IL-1、IL-8、TNF-α含量明显增加，滑膜组织中MyD88 、TRAF6 、TBK1和NF-κB 的表达明显增加，灌胃给予不同浓度的豨莶草提取物和秋水仙碱发现大鼠血清中IL-1、IL-8、TNF-α含量明显降低，滑膜组织中MyD88 、TRAF6 、TBK1和NF-κB的表达明显降低，同时结合病理学结果发现模型组滑膜组织中滑膜细胞增生、成纤维细胞增生和炎症明显；不同浓度的豨莶草水提物和秋水仙碱组炎性细胞浸润明显减少，滑膜细胞增生和成纤维细胞增生明显减轻，表明豨莶草和秋水仙碱能够明显改善痛风性关节炎症状及炎性因子的释放。

TRL4信号通路的激活与疾病的发生发展密切相关，本项目发现模型组大鼠滑膜组织中MyD88、TRAF6、TBK1和NF-κB表达明显增加，IL-1、IL-8、TNF-α表达明显升高，说明痛风性关节炎异常激活TRL4信号通路，豨莶草水提物和秋水仙碱能够明显降低炎性因子的分泌和释放。综上所述，本研究以痛风性关节炎为研究基础，通过观察豨莶草水提物对痛风性关节炎炎性因子和病理学情况表明痛风性关节炎异常激活TRL4信号通路，豨莶草能够降低TRL4信号通路的异常激活，可以明显改善痛风性关节炎炎症反应。

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EffectsofHerbaSiegesbeckiaeonGoutyArthritisBasedonTLR4SignalingPathway

XU Yi-er1, Yu Xue-feng2, CHEN Shui-lin2, HAN Zhong-li3, SUN Gui-cai2

(1.PharmaceuticalAcademyofHarbinPharmaceuticalGroupHoldingCo,.Ltd,Harbin150025,China; 2.TheFourthAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang330003;China; 3.TheSecondAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin150086,China)

Objective: To investigate the effects ofHerbaSiegesbeckiaeon gouty arthritis based on TLR4 signaling pathway. Methods: 48 SD rats were randomly divided into the blank control group(BG), the model group(MG), Colchicine group(CG), Herba Siegebeckiase group(HSG)(4 g/kg, 2 g/kg, 1 g/kg ), in which BG and MG were administrated with normal saline and the other groups had been given the corresponding drug for 7 days. On 7th day, sodium uric acid was injected into the rats' knee joint cavity to establish gout arthritis model 1 hour after the administration. HE staining was used to observe the pathological changes of synovial tissue. Levels of TNF-α, IL-8 and IL-1 in serum were detected by ELISA; Expressions of MyD88, TRAF6 , TBK1 and NF-κB mRNA were determinated with RT-PCR. Results: Inflammatory cell infiltration, proliferations of synovial cell and fibroblast were obviously in MG compared to BG, and different concentrations ofHerbasiegebeckiasecould improve those changes. The levels of TNF-α, IL-1 and IL-8 were significantly increased in MG; however, they were significantly reduced in different concentration ofHerbaSiegesbeckiaegroup; the expressions of MyD88, TRAF6, TBK1, and NF-κB mRNA were significantly increased, whereas they were greatly decreased in different concentration ofHerbaSiegesbeckiaegroup. Conclusion:HerbaSiegesbeckiaecan significantly improve the symptoms of gouty arthritis, and suppress the abnormal activation of TLR4 signaling pathway.

HerbaSiegesbeckiae; Gouty arthritis; TLR4; MyD88; TRAF6; NF-κB

R285.5

A

1002-2392(2017)06-0028-04

2017-08-25

2017-11-18

国家自然科学基金项目(81360553)

徐轶尔(1985-)，男，硕士，助理研究员，研究方向:中药药理及分子生物学。

*通讯作者：孙贵才(1970-)，男，博士，主任医师，从事中西医结合治疗骨关节病。