突发性聋免疫损伤证据：MMP-9表达下调及意义

卢韬 康厚墉 胡国华 钱怡 邹祺缘 庞颖 曾继红

重庆医科大学附属第一医院耳鼻喉咽喉科（重庆400016）

突发性聋免疫损伤证据：MMP-9表达下调及意义

卢韬 康厚墉 胡国华 钱怡 邹祺缘 庞颖 曾继红

重庆医科大学附属第一医院耳鼻喉咽喉科（重庆400016）

目的已有研究显示基质金属蛋白酶9（MMP-9）参与了系统性红斑狼疮的免疫损伤过程。本研究拟检测突发性聋患者血清MMP-9表达水平，探究突发性聋是否也存在类似损伤机制。方法采用ELISA方法检测自2015年11月至2016年1月在重庆医科大学附属第一医院耳鼻咽喉科住院的43例突发性聋患者以及同期23例健康对照组志愿者血清中MMP-9的含量。结果对照组血清MMP-9平均浓度310.85±218.27ng/ml，患者组MMP-9平均浓度73.45±51.59ng/ml，其中低频型56.28±39.22ng/ml，高频型86.30±49.91 ng/ml，平坦型61.01±47.77ng/ml，全聋型85.51±58.69ng/ml。突发性聋患者血清MMP-9表达水平均明显低于对照组（H=32.526，P＜0.01），不同分型间血清MMP-9浓度差异无统计学意义（P＞0.05）。结论MMP-9在突发性聋患者血清低表达，可能与其参与了内耳免疫损伤而大量消耗有关。推测MMP-9可能通过介导免疫损伤的方式参与了该病的发生发展。

突发性聋基质金属蛋白酶9免疫损伤

突发性聋在全球范围内都有较高的发病率。据报道，每年发病率约在5-30人/10万人，且有每年增加的趋势[1-3]。激素作为免疫抑制剂在突发性聋治疗中一直起着重要作用，但其作用机制也未探明。

基质金属蛋白酶(MMPs)是由锌离子依赖性酶组成的一个大家族，参与细胞外基质的降解，主要涉及动脉粥样硬化、肿瘤侵蚀及自身免疫性疾病。系统性红斑狼疮（SLE）作为典型的自身免疫性疾病，国内外研究已发现SLE患者血清MMP-9含量显著低于正常人群，且活动期含量较缓解期更低，这与MMP-9在动脉粥样硬化及肿瘤侵蚀两方面的研究结果相反。本研究通过对比检测突发性聋患者与正常人群血清MMP-9水平，以期探讨血清MMP-9表达水平变化是否与突发性聋发生发展有关，以及该病是否也存在与SLE类似的免疫损伤机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料：选取自2015年11月至2016年1月在重庆医科大学附属第一医院的突发性聋住院患者43例，其中男性20例，女性23例，年龄16-81岁，平均年龄45岁，诊断均符合2015年我国突发性耳聋治疗指南诊断标准，并按照诊断标准分为低频、高频、平坦、全聋型。其中低频型9例，高频型7例，平坦型11例，全聋型16例。低频型平均听阈（500、1000、2000、4000HZ）21.11±5.39dB高频型为49.82±31.52dB，平坦型为50.45±13.62dB,全聋型为97.97±21.31dB。对照组选取身体健康，无高血压、糖尿病等疾病健康体检人群25例，其中男性6例，女性22例，年龄15-53岁，平均年龄为33岁。对照组与实验组间性别、年龄均无统计学差异。所有受试者均签署经重庆医科大学附属第一医院临床试验伦理委员会审核通过的知情同意书。

1.2 试剂：MMP-9酶联免疫试剂盒选自美国R＆D公司DMP-900型号。

1.3 仪器：酶标仪选用Thermo公司Multiskan Go全波长酶标仪。

1.4 方法：所有受试者均采集空腹静脉血5ml（突发性耳聋患者均于开始治疗前采集），静止沉淀6h后离心提取上清液，贮存于-80℃冰箱。采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清MMP-9水平。

1.5 统计学方法：采用SPSS17.0分析结果，血清MMP-9检测结果均以均数±标准差表示，采用秩和检验统计实验组与对照组MMP-9血清含量差异以及各亚型间MMP-9血清含量差异。

2 结果

对照组血清MMP-9平均浓度310.85±218.27ng/ml，患者组MMP-9平均浓度73.45±51.59ng/ml，其中低频型56.28±39.22ng/ml，高频型86.30±49.91 ng/ml，平坦型61.01±47.77ng/ml，全聋型85.51±58.69 ng/ml。突发性耳聋患者血清MMP-9浓度均明显低于对照组（Z=-5.520，P＜0.01），不同分型间血清MMP-9浓度差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 对照组与患者组血清MMP-9含量结果(n=68)Table1The concentration of serum MMP-9 in patientsand control group(n=68)

3 讨论

MMP是一类含锌离子的能够降解细胞外基质的酶家族，根据其降解产物不同分为四类，MMP-9是其中一类，主要来源于T细胞及巨噬细胞。它受IL-1β、TNF-α、IL-6的表达调控[4]，是降解IV型胶原的主要分子，能降解细胞外基质，促进炎症细胞往更深层次浸润。国内外对于MMP-9的研究现在主要集中于动脉粥样硬化、肿瘤侵蚀及自身免疫性疾病三个方面。朱嘉俊等人[5]发现在冠状动脉粥样硬化性心脏病的患者血清中MMP-9的含量明显高于正常人群，其中急性ST段抬高性心肌梗死的患者较急性非ST段抬高性心肌梗死及不稳定性绞痛患者血清中MMP-9的含量更高，认为这与MMP-9导致动脉粥样硬化斑块纤维骨架中胶原降解，影响斑块稳定性有关。Higo S等在心肌梗死的患者中找到了相同的结果，他们还发现经过冠状动脉造影术后患者血清中MMP-9含量较术前有升高，提示MMP-9在冠状动脉处狭窄处有大量聚集[6]。同样的结果可以在脑梗死以及肺癌、肝癌等恶性肿瘤的扩散中找到，患者组血清MMP-9含量均显著高于对照组，提示MMP-9起着降解细胞外基质，破坏血管基底膜的完整性，促进斑块脱落或者肿瘤的转移。但在自身免疫性疾病中的结果却不尽相同。

系统红斑型狼疮（SLE）作为典型的一类自身免疫性疾病，目前多考虑与免疫系统紊乱有关。Robak等人对41例SLE患者研究发现发现在系统性红斑狼疮患者血清中MMP-9含量明显低于正常人群，且活动期的含量低于缓解期。他们认为MMP-9血清含量的降低是由于MMP-9在肾小球局部受损血管处大量聚集所致[7]。Liu Y等人通过对36例SLE患者研究亦发现相同现象，他们还发现服用糖皮质激素后患者血清中MMP-9含量较治疗前有明显提高[8]。

研究证实内耳并非免疫豁免器官，Quicr早在1973年就发现抗耳蜗血管纹抗体与肾小球血管及上皮成分呈特异性反应，龚树生等人也发现抗肾小球基底膜抗体可同时作用于内耳血管纹和螺旋韧带[9-10]。这也可以从氨基糖苷类抗生素对内耳和肾脏均具有相似的毒副作用而窥见一斑。裴宏恩等人通过对中毒庆大霉素豚鼠研究发现肾小管上皮混浊肿胀同时，内耳毛细胞明显受损，提示内耳与肾同为受害组织[11]。Alport’s综合征作为一类典型的肾、内耳损伤并存的遗传性疾病，电镜下可见患者肾小球基膜有不同程度的厚薄不均、皱缩、断裂分层化及网状样变[12-13]。而通过颞骨标本还发现患者常有血管纹和螺旋韧带的萎缩退变,耳蜗神经元的丢失及血管纹上非特异性碱性物质的沉积[14]。这些都说明内耳与肾脏之间的关系紧密。

突发性聋作为一类有较高发病率的耳鼻喉科急症，现病因仍不明。只有不足15%的患者能在发病期间明确病因，因此寻找病因，对因治疗是治疗突发性聋的关键所在。中国2013年突发性耳聋多中心临床研究提示，低中频下降型有效率最高，为90.73%；平坦型次之，为82.59%；全聋型最低为70.29%[15]。该研究指出糖皮质激素对各型突聋均有效，这与Nakache等人的研究结果相近，他们发现约83%的患者使用糖皮质激素治疗后有效[16]。这些都提示糖皮质激素这一免疫抑制药物或许在突发性聋治疗中起着更大的作用。

而国内不少学者早已发现在突发性聋患者血清中同型半胱氨酸含量高于正常人群[17-18]。而王立忠等人通过对40只新西兰兔研究指出高同型半胱氨酸可造成MMP-9在血管壁上高表达[19]，陈黎红等人通过对高同型半胱氨酸处理的小鼠背部成纤维细胞分析亦指出相同观点[20]。

综上我们推测突发性聋或许与系统性红斑狼疮在病因机制上可能有相同点——都是通过免疫损伤而介导的一类疾病。而本研究中发现患者组血清MMP-9含量明显低于正常人群，这与Robak等人在系统性红斑狼疮中的发现极为相似。同时笔者还发现在不同亚型之间，MMP-9的含量无差异。这也从另一个方面证实免疫损伤可能参与了所有类型的突发性聋发生与发展。

众所周知，分布于耳蜗的毛细胞在人听觉产生起着极其重要的作用，近来有研究显示以Dieter细胞为主的支持细胞，能通过去极化直接影响外毛细胞的功能状态[21]。同时毛细胞的生存还需要血管纹的正常功能[22]。我们推测MMP-9可能在内耳沉积，破坏内耳细胞外基质，加重炎症细胞的浸润，从而引发免疫异常。而且这种免疫损伤是非特异性的，可能直接作用于毛细胞、毛细胞周围支持细胞，特别是Deiter细胞，导致内耳毛细胞功能下降，从而引发不同亚型的突发性聋。还可通过破坏血管纹细胞，间接影响毛细胞功能，继而导致突发性聋。这些非特异性免疫损伤与各亚型间MMP-9含量无差异的结果相符合，它可能成为突发性聋发生的初始诱因之一。此后，MMP-9可通过对内耳血管内皮细胞外基质的降解，破坏血管基底膜，介导血管内皮的损伤及炎症细胞的深层次浸润，从而导致内耳的缺血缺氧，这也与目前临床上运用改善循环药物治疗突发性耳聋有效亦相符合。综上，我们推测免疫损伤可能是突发性聋更为重要的发病机制，而MMP-9可能在其中发挥着重要的作用。

目前国内外对MMP-9与突发性耳聋关系的研究较少，本研究通过对突发性耳聋患者血清中MMP-9含量的测定，发现患者组MMP-9含量明显低于对照组，且各亚型间无差异，虽然足以说明MMP-9与突发性耳聋的发病有关，但作为间接证据，尚不能直接阐明MMP-9如何通过免疫损伤机制诱导介入突发性耳聋的发生发展。此一问题，可留待今后深入研究突发性聋发病机制解答。

1Alexander TH,Harris JP.Incidence of Sudden Sensorineural Hearing Loss[J].Otol Neurotol,2013,Dec;34(9):1586-9.

2Wu C S,Lin H C,Chao P Z.Sudden Sensorineural Hearing Loss:Evidence from Taiwan[J].Audiol Neurootol,2006,11:151-6.

3Teranishi M,Katayama N,Uchida Y,et al.Thirty-year Trends in Sudden Deafness from Four Nationwide Epidemiological Surveys in Japan[J].Acta Otolaryngol,2007,127:1259-65.

4王海波,俞为荣.MMP-2/MMP-9在炎症中的研究进展[J].医学综述,2014,20(17);3120-3122.Wang HB,Yu WR.Advances in the Research of MMP-2/MMP-9 in Inflammation[J].Medical Recapitulate,2014,20(17);3120-3122.

5朱嘉俊,徐锐,杨毅宁等.金属基质蛋白酶-9预测早发急性冠脉综合征患者冠状动脉病变程度的临床研究[J].中国现代医学杂志,2015,(16):32-36.Zhu JJ,Xu R,Yang YN,et al.Relationship between Serum Matrix Mettalloproteinase-9（MMP-9）Level and Severity of Coronary Lesions in Premature Acte Coronary Syndrome.China Journal of Modern Medicine,2015,(16):32-36.

6Higo S,Uematsu M,Yamagishi M,et al.Elevation of Plasma Matrix Metalloproteinase-9 in the Culprit Coronary Artery in Patients with Acute Myocardial Infarction:Clinical Evidence from Distal Protection[J].Circ J.,2005,Oct;69(10):1180-5.

7Robak E,Wierzbowska A,Chmiela M,et al.Circulating Total and Active Metalloproteinase-9 and Tissue Inhibitor of Metalloproteinases-1 in Patients with Systemic Lupus Erythomatosus[J].Mediators of Inflammation,2006,2006(1):17898.

8Liu Y,Tie N,Bai L.Serum Levels of MDC and MMP-9 and the Relationship between Serum Levels and Disease Activity in the Patients with Systemic Lupus Erythematosus[J].Pak J Med Sci,2015Jul-Aug,31(4):803-6.

9龚树生,汪吉宝,廖新波.内耳与肾相同抗原性的实验研究（摘要）[J].中华耳鼻咽喉科杂志,1994,(01):9.Gong SS,Wang JB,Liao XB.Research of the Same Antigenicity on the Inner Ear and Kidney.Chinese Journal of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery,1994,(01):9.

1013黄雯,石义霞.肾脏疾患与听力障碍[J].国外医学：耳鼻咽喉科学分册,1998,22(6):354-357.Huang W,Shi YX.Kidney Diseases and Hearing Impairment[J].Foreign Medical Sciences(Section of Otolray Ngology Foreign Medical),1998,22(6):354-357.

11裴宏恩,汪磊,姜伟等.豚鼠庆大霉素耳毒性实验研究[J].海军医学,1987,(02):34-39+81.Pei HE,Wang L,Jiang W,et al.Study on Ototoxicity of Gentamicin in Guinea Pigs[J].Journal of Navy Medicine,1987,(02):34-39+81.

12崔晓玲,刘桂茹.遗传性进行性肾炎（Alport‘s综合征）6例报告：附病理结果[J].中华肾脏病杂志,1989,5(3):161-162.Cui XL,Liu GR.Report of 6 Cases of Hereditary Progressive Nephritis(Alport’s Syndrome):Pathological Findings[J].Chinese Journal of Nephrology,1989,5(3):161-162.

14刁刃,裴兰.中医“肾”与耳的相关——现代医学的证据[J].中国中西医结合耳鼻咽喉科杂志,2000,8(4):203-207.Diao R,Pei L.Relationship between Chinese Medcine“Kidney”and Ear--Evidence of Modern Medicine[J].Chinese Journal of Otorhinolaryngology of Integrated Traditional and Western Medicine,2000,8(4):203-207.

15中国突发性耳聋多中心临床研究写作组.中国突发性聋分型治疗的多中心临床研究[J].中华耳鼻咽喉头颈外科杂志,2013,48(5);355-361.Chinese Sudden Hearing Loss Multi-Center Clinical Study Group.Prospective Clinical Multi-Center Study on the Treatment of Sudden Deafness with Different Typings in China[J].Chinese Journal ofOtorhinolaryngologyHeadandNeckSurgery,2013,48(5);355-361.

16Nakache G,Migirov L,Trommer S,Drendel M,Wolf M,Henkin Y.Steroid-based Treatments for Patients with Total Sudden SensorineuralHearingLoss[J].ActaOtolaryngol.2015Sep;135(9):907-13.doi:10.3109/00016489.2015.1034881.

17敖华飞.突发性耳聋患者血浆同型半胱氨酸血症与凝血-纤溶系统的变化[J].复旦学报：医学版,2006,33(6):741-744.Ao HF.Changes of Plasma Homocysteine System and Coagulation-fibrinolysis in Patients with Sudden Sensorineural Hearing Loss[J].Fudan University Journal of Medical Sciences,2006,33(6):741-744.

18陈宏,张学艳.血清同型半胱氨酸在突发性耳聋患者中的表达及相关因素分析[J].河北医药,2016,38(4):562-564.Chen H,Zhang XY.Expression and Related Factors of Serum Homocysteine in Patients with Sudden Sensorineural Hearing Loss[J].Hebei Medical Journal,2016,38(4):562-564.

19王立忠,尚小明,李燕.同型半胱氨酸对颈动脉平滑肌细胞增殖和氧化及基质金属蛋白酶-9表达的影响[J].中国全科医学,2010,13(29):3298-3301.Wang LZ,,ShangXM,Li Y.Effects of Homocysteine on Proliferation and Oxidation and Expression of Matrix Metalloproteinase-9 in Carotid Artery Smooth Muscle Cells[J].Chinese General Practice,2010,13(29):3298-3301.

20陈黎红,谢晓英,杨川等.高糖与同型半胱氨酸对大鼠皮肤成纤维细胞MMP-9表达及活性的影响[J].中国病理生理杂志,2010,26(9):1839-1843.Chen LH,Xie XY,Yang C,et,al.Effects of High Glucose and Homocysteine on Expression of MMP-9 in Rat Fibroblasts[J].Chinese Journal of Pathophysiology,2010,26(9):1839-1843.

21于宁,翟所强,杨仕明等.耳蜗支持细胞调控外毛细胞功能的研究[A].中华医学会、中华医学会耳鼻咽喉头颈外科分会.全国耳鼻咽喉头颈外科中青年学术会议论文汇编[C].中华医学会、中华医学会耳鼻咽喉头颈外科分会:2012:1.Ding N,Zhai SQ,Yang SM,et al.Study on the Function of Cochlear Supporting Cells in Regulating Outer Hair Cells[A].Chinese Medical Association、National Conference of Otolaryngology Head and Neck Surgery,Chinese Medical Association、Youth National Conference of Otolaryngology Head and Neck Surgery Proceedings.Chinese Medical Association、National Conference of Otolaryngology Head and Neck Surgery,Chinese Medical Association:2012:1.

22李轶,刘会占,龚树生等.耳蜗毛细胞与血管纹的相互依存关系的研究[J].中华耳科学杂志,2014,03:475-480.Li Y,Liu HZ,Gong SS,et al.Relationship between Survival of Organ of Corti and Stria Vascularis,Chinese Journal of Otology,2014,03:475-480.

Evidence of Immunologic Injury in Sudden Sensorineural Hearing Loss:Down Regulation of Serum MMP-9 Expression and Its Significance

LU Tao,KANG Houyong,HU Guohua,QIAN Yi,ZOU Qiyuan,PANG Ying,ZENG Jihong
Department of Otorhinolaryngology,First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University
Corresponding author:KANG HouyongEmail:kanghouyong@sohu.com

ObjectiveMatrix metalloproteinase 9(MMP-9)has been shown to be associated with immune injury in systemic lupus erythematosus(SLE).This study aims to test the concentration of serum MMP-9 in patients with sudden sensorineural hearing loss(SSNHL)and to investigate whether there is a similar MMP-9 associated injury mechanism in this disease.MethodsForty-three patients with SSNHL and 23 healthy volunteers were studied from November 2015 to January 2016.Serum MMP-9 was tested by ELISA.ResultsAverage serum MMP-9 concentration was 310.85±218.27 ng/ml in the control group,compared with the much lower 73.45±51.59 ng/ml in the experiment group,(56.28±39.22 ng/ml in those with low frequency SSNHL,86.30±49.91 ng/ml in those with high frequency SSNHL,61.01±47.77 ng/ml in those with flat type SSNHL,and 85.51±58.69 ng/ml in those with total deafness)(H=32.526,P＜0.01).Serum MMP-9 levels were not significantly different among different SSNHL types(P＞0.05).ConclusionsDecrease of serum MMP-9 in patients with SSNHL may be related to excessive consumption in the process of auto-immune damage in the inner ear.It is speculated that MMP-9 may participate in the occurrence and development of the disease via immune injury.

Sudden Sensorineural Hearing Loss;Matrix Metalloproteinase 9;Immune Injury.

康厚墉，Email:kanghouyong@sohu.com

R764

A

1672-2922（2017）05-542-4

Funding Projects:the National Natural Science Foundation of China(No.81170926)

Competing Interests:The authors have declared that no competing interests exist.

10.3969/j.issn.1672-2922.2017.008.

国家自然科学基金（编号：81170926）

卢韬，硕士研究生，研究方向：耳科学

2017-04-13审核人：翟所强）