好食脉孢菌发酵醋糟产类胡萝卜素的工艺研究

王倩男，辛嘉英，郑洛昀，陈书明，李家柔

（1.哈尔滨商业大学食品科学与工程重点实验室，黑龙江哈尔滨 150076；2.山西农业大学动物科技学院，山西晋中 030800）

好食脉孢菌发酵醋糟产类胡萝卜素的工艺研究

王倩男1，*辛嘉英1，郑洛昀1，陈书明2，李家柔1

（1.哈尔滨商业大学食品科学与工程重点实验室，黑龙江哈尔滨 150076；2.山西农业大学动物科技学院，山西晋中 030800）

以原本废弃的醋糟为主要原料，通过好食脉孢菌发酵醋糟产类胡萝卜素，从而提高醋糟的营养价值，使其成为可食用的饲料，继而达到废物利用的效果。先确定醋糟的主要营养成分，再以类胡萝卜素含量为测定指标，考查了不同发酵条件对好食脉孢菌发酵醋糟产类胡萝卜素的影响，分别筛选出培养基中最佳氮源及最佳氮源的添加量、确定最佳的水分添加量、培养基最佳pH值、培养基最优初装量及接种量。在单因素试验的基础上，经正交试验优化培养条件，确定最佳反应条件为氮源豆渣添加量12%，水添加量9 mL/12 g，培养基pH值6，培养基初装量12 g/250 mL，接种量4 mL，在此条件下类胡萝卜素含量可达117.68 μg/g。

好食脉孢菌；醋糟；类胡萝卜素

醋糟利用方式主要是作为饲料和培养基原料[1]，如作为饲料，醋糟主要用于制备动物的日粮而被直接应用，这样还可替代一部分其他饲料，降低了成本[2]。醋糟中粗纤维含量较高，在生产加工后可回收利用，如果饲喂动物，适口性会较差，且其营养物质利用率太低，醋糟中纤维素结构紧密，微生物难以降解，所以醋糟的再利用对降低环境污染也有着重要意义[3-4]。

通过用好食脉孢菌发酵醋糟，好食脉孢菌酶系广泛，主要由纤维素酶、糖化酶和蛋白酶等组成[5]，其可以充分利用醋糟中的营养物质，尤其是其中大量的碳源，产生类胡萝卜素，人们通常了解到的类胡萝卜素主要包括胡萝卜素、β-类胡萝卜素、β-隐黄质、类胡萝卜素和酵母红素，它们都是VA的前体[4-5]，人类和动物可以利用这些衍生物转化成为视黄醛再转化为视黄醇。胡萝卜素主要作为VA、天然食品和饲料着色剂，在医药、化工、食品等行业的使用越来越广泛[6-8]。希望能进行工业化生产，这样既能减轻环境污染，又可提供优质饲料，还能变废为宝。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

MgSO4（分析纯），国药集团上海试剂公司提供；HCl（36%），天津市天力化学试剂有限公司提供；NH4Cl（分析纯），济宁百川化工有限公司提供；蛋白胨（分析纯），上海一研生物科技有限公司提供；丙酮（分析纯），天津市永大化学试剂有限公司提供；乙醚（分析纯），深圳市旭升化工有限公司提供；硫酸（分析纯），深圳市旭升化工有限公司提供。

1.2 主要仪器

UV-2550型紫外-可见分光光度计，杭州汇尔有限公司产品；HDL型洁净工作台，北京东联哈尔仪器公司产品；HZQ-D型恒温振荡器，哈尔滨东联电子技术开发公司产品；TGL-16G型高速离心机，上海安亭科学仪器公司产品；LDZX-50KB型立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械公司产品；电子显微镜，上海光学仪器一厂产品；BS210S型电子天平，德国Sartorius仪器公司产品；DHG-9203A型电热恒温鼓风干燥箱，上海-恒科学仪器有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 好食脉孢菌培养基的制备

准确称取新鲜的马铃薯200 g，切碎后沸水中煮5～8 min，待其冷却后，用80目单层纱布过滤，取上清液，向上清液中添加葡萄糖20 g/L，琼脂20 g/L，加蒸馏水定容到1 000 mL，pH值自然，装于三角瓶中，于121℃下湿热灭菌30 min后摆斜面。于30℃条件下培养96 h，备用。

1.3.2 好食脉孢菌种子液的制备

称取3 g麸皮加入100 mL蒸馏水中，浸泡过夜然后用4层纱布过滤，取上清液。称取1.5 g蛋白胨，pH值自然，分装至250 mL锥形瓶，装量为50 mL/250 mL，121℃湿热灭菌30 min。同时灭菌装量为30 mL/250 mL锥形瓶的带有20个玻璃珠的蒸馏水。

在无菌条件下向斜面培养基中倒入冷却后的无菌水至没过斜面，轻晃洗下斜面表面的孢子，倒回有20个玻璃珠的锥形瓶中，于摇床振荡2 h，此时制备出的液体称为脉孢霉孢子悬液。

1.3.3 醋糟营养成分的测定方法

用范氏（Van Soest）法分别测定中性洗涤纤维（DNF）、酸性洗涤纤维（ADF）、计算半纤维素、纤维素和木质素的含量。半纤维素=中性洗涤纤维-酸性洗涤纤维，纤维素=酸性洗涤纤维-酸性洗涤木质素，木质素=酸性洗涤木质素-灰分。

粗脂肪含量测定采用索氏提取法；灰分的测定采用GB 5009.4—2010；粗蛋白含量测定采用凯氏定氮法。

1.3.4类胡萝卜素的提取——丙酮提取法

将发酵好的物质烘干粉碎取1 g加入20 mL盐酸（3 mol/L），放入摇床振荡45 min，然后放入沸水浴中加热5 min。将经上述处理后的菌体，以转速8 000 r/min离心10 min，取上清液，清水离心2次，去上清液，吸取15 mL丙酮加至沉淀中，于30℃振荡提取20 min，以转速8 000 r/min离心10 min，取上清液。适当稀释后用WFZ UV-2000紫外可见分光光度计测定其475 nm吸光度。类胡萝卜素的计算公式如下：

式中：Aλmax——色素最大吸收波长处的吸光度；

D——测定试样的稀释倍数“1”；

V——提取色素用有机溶剂体积，mL；

W——发酵液体积，mL；

0.16——类胡萝卜素的摩尔消光系数，L/（mg·cm）。

在上式中W指发酵液体积，mL，则计算结果单位是μg/mL，即mg/L。

2 结果与讨论

2.1 醋糟中营养成分的测定

醋糟中营养成分含量见表1。

表1 醋糟中营养成分含量/%

由表1可知，醋糟中的粗蛋白含量约13.13%，粗脂肪13.76%，粗纤维29.75%，灰分7.09%。根据研究分析表明醋糟中还有钙0.42%，磷0.19%等矿物质元素[9]。通过对醋糟营养成分的测定，对醋糟得到进一步了解，也为醋糟能够变废为宝奠定了坚实而有力的基础。

2.2 好食脉孢菌色素全波长扫描图谱

好食脉孢菌类胡萝卜素丙酮提取液全波长扫描见图1。

图1是按料液比1∶25加入丙酮类胡萝卜素在紫外分光光度计中的扫描图，色素提取液在415.5，460.6，482.5 nm处有最大吸收峰，与相关文献报道一致[10]。

图1 好食脉孢菌类胡萝卜素丙酮提取液全波长扫描

2.3 影响好食脉孢菌发酵醋糟产类胡萝卜素的因素

2.3.1 氮源的选择与优化

在以最佳酶水解后醋糟产的还原糖为碳源，分别加入豆渣、豆粕、蛋白胨和NH4Cl，添加量均为1 g/L，接菌量1 mL/瓶，于28℃条件下培养48 h，在475 nm处测定类胡萝卜素含量，以选出最佳氮源测定。

不同氮源对醋糟产类胡萝卜素的影响见图2。

图2 不同氮源对醋糟产类胡萝卜素的影响

由图2可知，培养后，得到豆渣在475 nm处的吸光度最大，类胡萝卜素素含量为62 μg/g，由此选豆渣为最佳氮源。基于以上结果，筛选出最适氮源的添加量。

豆渣添加量对醋糟产类胡萝卜素的影响见图3。

图3 豆渣添加量对醋糟产类胡萝卜素的影响

随着豆渣添加量的增长，类胡萝卜素的含量及色素产量呈现明显上升趋势，当添加量为8%时，上升开始减缓，当添加量到10%～12%时，上升更加迟缓，所以判断添加量为12%时类胡萝卜素含量最高。随着豆渣的添加量增加，氮源不断满足菌种生长所需的营养，当豆渣添加到一定含量时，营养充足，菌种数达饱和，醋糟产类胡萝卜素含量也不再升高。所以12%为豆渣最适添加量。

2.3.2 水添加量对醋糟产类胡萝卜素的影响

微生物繁殖过程中，水添加量对其生长繁殖起到至关重要作用。所以分别向含12%豆渣的12 g/mL的固体培养基中，接种1 mL种子液，发酵温度28℃，发酵时间120 h。培养基中加入3，6，9，12，15 mL的蒸馏水，后在475 nm处测定类胡萝卜素含量，以未接菌的醋糟培养基为对照。

12 g/250 mL培养基中水添加量对醋糟产类胡萝卜素的影响见图4。

图4 12 g/250 mL培养基中水添加量对醋糟产类胡萝卜素的影响

微生物正常代谢物质需要水作为载体，吸收营养、排泄废物，所以水对好食脉孢菌的生长繁殖至关重要。随着水添加量的增加，类胡萝卜素量在缓慢增长，可能是因为水分含量不够，不能使好食脉孢菌细胞进行正常的生长繁殖活动所致。当水添加量为9 mL/12 g时，类胡萝卜素量达到最佳，之后缓慢下降，分析其原因可能是含水量过大，导致培养基中氧气变少，减缓好食脉孢菌正常生长繁殖代谢。

2.3.3 初始pH值对产类胡萝卜素的影响

好食脉孢菌，有其适宜的生长pH值，因此pH值也是影响其产类胡萝卜素的关键。为上述培养基（添加12%豆渣、9 mL蒸馏水）的基础上，接菌量1 mL/瓶，发酵温度28℃，培养时间120 h。分别选择初始pH值为3，4，5，6，7进行试验。在475 nm处测定类胡萝卜素含量，以未接菌的醋糟培养基为对照。

培养基初始pH值对醋糟产类胡萝卜素的影响见图5。

图5 培养基初始pH值对醋糟产类胡萝卜素的影响

由图5可知，pH值为3～5时由于高酸性环境下，好食脉孢菌对培养基中营养物质吸收和利用率会很低，好食脉孢菌正常代谢和繁殖受到影响，从而色素产量低。当pH值为6时，类胡萝卜素积累量最多；pH值为7时，色素量又有小幅下降，可能是因为好食脉孢菌在中性偏酸性环境生长较为适宜，同时偏酸还可以抑制杂菌类生长，对色素的大规模生产也极其有利。因此，得到初始pH值6为最佳。2.3.4 培养基装量对醋糟产类胡萝卜素的影响

在上述培养基的基础上配制60 g于1 000 mL烧杯中，用玻璃棒搅拌均匀，分别以4，8，12，16，20 g/250 mL培养基装量进行试验，含水量按照上述适当比例添加，初始pH值为6，接菌量1 mL/瓶，发酵温度28℃，培养时间120 h。在475 nm处测定类胡萝卜素含量，以未接菌的醋糟培养基为对照。

250 mL培养瓶中基装量对醋糟产类胡萝卜素的影响见图6。

图6 250 mL培养瓶中基装量对醋糟产类胡萝卜素的影响

由图6可知，当培养基装量在12 g/250 mL时，色素量达到最大，当装量过少时，营养成分相对较少，不能满足好食脉孢菌的是正常生长繁殖。当装量过大，容氧量相对减少，从而抑制好食脉孢菌正常代谢，所以选择基装量为12 g/250 mL为发酵的最优固态培养基装量。

2.3.5 接种量对类胡萝卜素产量的影响

考虑到菌种生长和繁殖初期，接种量也影响着色素含量，所以分别选择1，2，3，4，5 mL接种量，装量12 g，其他条件同上，发酵温度28℃，培养时间120 h。在475 nm处测定类胡萝卜素含量，以未接菌的醋糟培养基为对照。

接种量对醋糟产类胡萝卜素的影响见图7。

图7 接种量对醋糟产类胡萝卜素的影响

由图7可知，随着培养基接种量的加大，好食脉孢菌的细胞生物量及色素产量均呈上升趋势，但当接种量从4 mL增加到5 mL时，好食脉孢菌的繁殖速度减慢，分析其原因，可能是因接种量过大导致发酵培养液的黏度增大，从而使得培养基中的溶解氧不足而导致好食脉孢菌繁殖速度减慢。另外过大的接种量也会对实际生产中种子液制备造成负担，所以选择4 mL为最适接种量。

2.4 好食脉孢菌发酵醋糟产类胡萝卜素试验条件的优化试验

2.4.1 正交试验水平的设定

在单因素的基础上，采用正交试验方法对影响产类胡萝卜素的因素进行分析及优化。

正交因素与水平设计见表2。

表2 正交因素与水平设计

2.4.2 正交试验方案及结果

采用水添加量（A）、初始pH值（B）、基装量（C）、接种量（D） 4个因素，每个因素设定3个水平，以类胡萝卜素含量（Y）为指标，设计试验。

好食脉孢菌产类胡萝卜素的正交试验方案及结果见表3。

表3 好食脉孢菌产类胡萝卜素的正交试验方案及结果

由表3可知，从表中可以看出好食脉孢菌发酵醋糟的最佳制作工艺为 B2＞C2＞A1＞D2，即初始 pH 值为6，水添加量9 mL，基装量12 g，接种量4 mL。进行醋糟发酵，可行稳定。

3 结论

研究不同氮源对醋糟产类胡萝卜素效果的影响，筛选了最适氮源，考查了影响产类胡萝卜素的因素，在单因素试验基础上，通过正交试验分析，得到好食脉孢菌发酵醋糟的最佳制作工艺为最佳组合初始pH值6，水添加量9 mL/12 g，基装量12 g/250 mL，接种量4 mL。最优条件下色素含量可达117.68 μg/g。其中，初始pH值是影响类胡萝卜素含量最重要的因素，利用好食脉孢菌固体发酵醋糟简单易行，类胡萝卜素含量得到了很大的提高，如果将这一技术进一步完善，并且应用到饲料深加工中，前景十分可观。

[1]杨庆文，彭晓光，杨林娥，等.醋糟的开发与利用 [J].山西农业科学，2009，37（2）：44-46.

[2]宋增廷，董晓芳，佟建明，等.醋糟的营养价值及其在饲料生产中的应用 [J].中国畜牧杂志，2011（9）：32-35.

[3]郑洛昀，辛嘉英，王艳，等.醋糟发酵红酵母产类胡萝卜素的研究 [J].农产品加工，2016（16）：1-5.

[4]Z Aksu A Eren.Carotenoids production by the yeast Rhodotorula mucilaginosa：use ofagricultural wastes as a carbon source[J].Process Biochem，2005（4）：2 985-2 991.

[5]胡建中.柑橘中类胡萝卜素的提取、分离、鉴定及其稳定性研究 [D].武汉：华中农业大学，2006.

[6]李晓银.柿子皮中类胡萝卜素化合物的分离鉴定及稳定性研究 [D].西安：西北工业大学，2006.

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[8]唐刚，陈育如，刘友芬.间型脉孢菌产类胡萝卜素研究 [J].南京师范大学学报（工程技术版），2009（1）：73-77.

[9]杨致玲，李建英，张栓林.微生物发酵可提高醋糟营养价值 [J].中国饲料，1999（6）：24-27.

[10]何文娟，王志，李雯，等.界面聚合制备含丙烯氧基团的复合膜用于CO2分离 [J].化工学报，2014（11）：4 420-4 429.

The Study on the Production of Carotenoids from Vinegar Residue by Neurospora sitophila

WANG Qiannan1，*XIN Jiaying1，ZHENG Luoyun1，CHEN Shuming2，LI Jiarou1
（1.Key Laboratory for Food Science and Engineering，Harbin University of Commerce，Harbin，Heilongjiang 150076，China；2.College of Animal Science and Veterinary Medicine，Shanxi Agricultural University，Jinzhong，Shanxi 030801，China）

The abandoned vinegar residue were used as the main raw material to produce carotenoid by the Neurospora sitophila fermentation，in order to improve the nutritional value of vinegar residue and make them into edible feed and achieve the utilization of waste products.Firstly，the main nutritional components of soybean residue were determined.By using carotenoid content as target，the effects of various factors on the carotenoid content were investigated.The optimal nitrogen source and the optimal amount of nitrogen source were selected.The optimal amount of water，the pH of the medium，the initial liquid volume and the inoculation amount of the medium were obtained.On the basis of single factor，the culture conditions were optimized by the orthogonal test and the optimal reaction conditions were determined：the best source of nitrogen was bean dregs，the amount of it was 12%，the moisture amount 9 mL/12 g，the pH of the medium 6，the initial liquid volume 12 g/250 mL，the inoculation amount of the medium was 4 mL.The carotenoid content can reach 117.68 μg/g.

Neurospora sitophila；vinegar residue；carotenoid

O643.32

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.11.033

1671-9646（2017） 11b-0024-04

2017-09-05

山西省重点研发计划（指南）项目（201603D221027-3）；山西省人才专项（优秀人才科技创新）项目（201705D211029）；哈尔滨商业大学创新团队项目（CX2016-9）。

王倩男（1993— ），女，硕士，研究方向为农产品加工及贮藏工程。

*通讯作者：辛嘉英（1966— ），男，博士，教授，博士生导师，研究方向为生物催化与生物转化。