痰热清注射液及药效成分黄芩苷对心梗模型小鼠心肌细胞损伤的保护作用

， ， 匡希

(1.南华大学附属第二医院药剂科,湖南 衡阳 421001;2.南华大学附属第二医院心血管内科)

·基础医学·

痰热清注射液及药效成分黄芩苷对心梗模型小鼠心肌细胞损伤的保护作用

英姿1*，黄斌2，匡希斌2

(1.南华大学附属第二医院药剂科,湖南 衡阳 421001;2.南华大学附属第二医院心血管内科)

目的探讨痰热清及其药效成分黄芩苷对小鼠心肌梗死后心肌细胞损伤的保护作用。方法将小鼠随机均分为假手术组、心梗模型组和痰热清高、中、低剂量组，以及高剂量组痰热清对应的黄芩苷含量100 mg/kg作为药效成分组。分别测定小鼠24 h心肌病理形态学检查、梗塞面积、心肌细胞凋亡数目比例、HMGB1、TLR4、NF-kB的表达活性、IL-6、TNF-α、MDA、caspase-3等指标。结果和心梗模型组相比，痰热清高剂量组与药效成分黄芩苷组均能显著改善心肌病理，降低梗死边缘区的心肌细胞凋亡率和梗死区面积，下调心梗小鼠心肌组织中HMGB1/TLR4/NF-kB信号通路以及IL-6、TNF-α、MDA、caspase-3的表达。结论痰热清与其药效成分黄芩苷具有类似的心脏保护药效，其机制涉及改善HMGB1/TLR4/NF-kB信号通路及下游炎性因子，氧化应激及凋亡因子的表达，从而降低小鼠心肌梗死后心肌细胞损伤。

痰热清； 黄芩苷； 心肌梗死； 细胞凋亡

急性心肌梗死是人类健康的重要杀手，其病理本质为冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死，炎性因子、氧化应激、细胞凋亡均参与了心梗后心肌损害的发生和发展[1]。心梗中医名为胸痹，古代文献虽然认为胸痹发病多为阳微阴弦，但古代医家提出的“热结心痛”“毒损心络”以及现代医家的临床研究发现均提示了心梗与痰热密切相关。痰热清注射液由黄芩、熊胆粉、山羊角、金银花和连翘组成，具有较强的清热、解毒、化痰之功。近几年痰热清在心血管内科的疗效也不断得到证实，既往文献报道了其对冠心病心绞痛，急性心梗，高血压和高血脂的疗效，与本院心内科的使用经验相吻合，引起了本文作者极大的兴趣[2-3]。本实验采用急性心肌梗死小鼠模型，观察痰热清对小鼠心肌梗死后心肌细胞凋亡及信号通路的影响，探讨痰热清对心脏保护的作用机制及可能的药效成分。

1 材料与方法

1.1实验动物与主要试剂8周龄的C57BL/6小鼠80只购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号SCXK(湘)2016-0002。痰热清购于上海凯宝药业股份有限公司，黄芩苷购于成都曼思特生物科技有限公司，纯度≥98%，HMGB1、TLR4、NF-kB抗体购于长沙鼎国生物技术有限公司，IL-6、TNF-α、MDA、caspase-3的ELISA试剂盒购于武汉华美生物工程有限公司。

1.2实验方法动物模型小鼠被40 mg/kg (腹腔注射)剂量的戊巴比妥钠麻醉。小鼠在气管导管插管后予呼吸器，用室内空气辅助通气，通气参数：潮气量8 mL/100 g，呼吸频率68 cycles/min，呼吸频率为2∶1。如果需要，实验中继续予麻醉药(一般不再给予)。在消毒条件下，从第四肋骨的位置进行胸廓切开手术。可以看见心脏悬浮在心包中。通过锥型针，用1.0号的丝线穿过左冠状动脉前降支的起始处，丝线两端之间，通过，试管用于当扎紧线时使冠状动脉闭塞。通过左心室相应阶段出现局部苍白、膨胀，心肌缺血得到确定[4]。将造模成功62只实验小鼠随机分六组(每组10只):(1)假手术组；(2)模型组：于术后腹腔注射生理盐水(3 mg/kg)溶液；(3)痰热清高(H-TRQ)、中(M-TRQ)、低剂量组(L-TRQ)：于术后30 min立即单次腹腔注射痰热清高剂量(18 mL/kg)、中剂量(6 mL/kg)和低剂量(2 mL/kg)溶液 ；(4)吸收成分黄芩苷组(BCL)：根据痰热清高剂量(18 mL /kg)中大约含黄芩苷100 mg/kg，于术后30 min立即腹腔注射黄芩苷100 mg/kg，与母方痰热清进行疗效对比。

1.3观察指标分别测定小鼠24 h心肌病理形态学检查(H&E染色)、梗塞面积、心肌细胞凋亡数目比例(TUNEL测定方法)、HMGB1、TLR4、NF-kB的表达活性(Western blot法)、IL-6、TNF-α、MDA、caspase-3(ELISA法)指标。

1.3.1 心梗大小测定 造模24 h后，于1 mL 2%亚斯兰染色剂于左心室注入，并将心肌组织用PBS冲洗3次，-20 ℃冰冻，并切成1 mm厚度薄片。用TTC孵育15 min，然后ImagePro-Plus 5.0.1计算危险区及非危险区。并统计分析[4]。

1.3.2 凋亡心肌细胞的定量使用TUNEL 心肌组织埋入paraffin封闭，每个组织切成5 μm厚度薄片，后使用蛋白酶K，组织切片用TUNEL反应，使用DAPI封固剂进行细胞核计数，至少每个封闭的5个切片计数。另外使用单克隆抗a辅肌动蛋白染色。每一个切片随机选取10个视野来计算凋亡指数[5]。

1.3.3 Western blot法测HMGB1、TLR4、NF-Kb表达

心肌组织一个加入胞浆提取混合液400 μL，在冰冻下用组织匀浆机匀浆。得到的浆液离心：700×g 10 min 4 ℃。收集上清液到新的一个EP管，离心：10 000×g 30 min 4 ℃。再次收集到的上清液作为胞浆提取物。将得到的组织液用BCA法进行蛋白定量。在做好的凝胶中上样，电泳，转膜，待凝胶上的蛋白转移到PVDF膜上后，将PVDF膜浸入5%milk封闭。37 ℃ 2 h或者4 ℃过夜。一抗(cyt C 与5%milk按照1∶300比例配置。例如：10 mL/300=33 μL)孵育,37 ℃ 2 h或者4 ℃过夜。冲洗：PBST缓冲液洗3次，10 min/次；加入二抗(抗体 与PBST缓冲液按照1∶20 000比例配置)，孵育,37 ℃ 1 h。冲洗：PBST缓冲液洗3次，10 min/次；PBS缓冲液洗1次，10 min。曝光，然后ImagePro-Plus 5.0.1分析图像[6]。心肌组织提取液IL-6、TNF-α、MDA、caspase-3的均采用武汉华美ELISA试剂盒说明书进行操作，反应结束后于全自动酶标仪上读取光密度值(波长450 nm)，绘制浓度曲线，计算样本光密度值对应的浓度范围。

2 结 果

2.1各组小鼠的心肌组织病理与心肌细胞凋亡比较如图1所示，假手术组大鼠心肌纤维呈粉红色，饱满整齐；心肌细胞浆染色均匀，细胞核分布均匀；心肌间质未见炎症细胞浸润。小鼠心梗后24 h，梗死边缘区心肌纤维排列紊乱、断裂，肌浆嗜酸性增强；心肌细胞结构不清，呈凝固性坏死；心肌间质可见较多炎症细胞浸润及炎症性充血，高剂量痰热清(18 mL/kg)组能显著改善心肌细胞变性、坏死及炎症细胞浸润,同时降低梗死边缘区的心肌细胞凋亡率和梗死区面积，(与盐水组相比均P<0.05)，同时高剂量痰热清中所含约100 mg/kg的黄芩苷也发挥了类似的心脏保护的药效，心肌细胞变性、坏死及炎症细胞浸润较少，且心肌细胞凋亡率与梗死区面积与盐水组相比均P<0.05。而痰热清低、中剂量均无明显改善梗死边缘区心肌组织病理和心肌细胞凋亡的作用。

2.2各组小鼠HMGB1/TLR4/NF-kB信号通路比较心梗模型组小鼠心肌组织的HMGB1/TLR4/NF-kB的表达显著升高(模型组与假手术组，均P<0.05，图2)，痰热清与药效成分黄芩苷均能显著降低心梗小鼠心肌组织中HMGB1/TLR4/NF-kB 的表达，提示药效成分黄芩苷发挥了类似与母方痰热清调节心梗小鼠心肌组织中HMGB1/TLR4/NF-kB信号通路的药效。

图1 小鼠心肌病理与梗死形态 *：与模型组相比P<0.05

图2 小鼠心肌组织Western blot检测 与假手术组相比，#：P<0.05;与模型组相比，*：P<0.05

2.3各组小鼠的炎性因子IL-6、TNF-α、氧化应激与凋亡因子MDA、caspase-3的表达比较心梗模型组小鼠心肌组织的IL-6、TNF-α、MDA、caspase-3的表达显著升高(模型组与假手术组，均P<0.05，图3)，痰热清与药效成分黄芩苷均能显著降低心梗小鼠心肌组织中IL-6、TNF-α、MDA、caspase-3 的表达(两组与模型组均P<0.05)，提示药效成分黄芩苷发挥了类似与母方痰热清调节心梗小鼠心肌组织中炎性因子IL-6、TNF-α、氧化应激与凋亡因子MDA、caspase-3的药效。

图3.小鼠心肌组织提取液ELISA检测 与假手术组相比，#：P<0.05;与模型组相比，*：P<0.05

3 讨 论

痰热清注射液由黄芩、熊胆粉、山羊角、金银花和连翘组成,其中黄芩为君药,具有清热燥湿,泻火清毒之功效;熊胆粉、山羊角为臣药,熊胆粉具有解痉、解毒、抑菌抗炎、镇咳、祛痰、平喘作用;山羊角具有显著的解热、镇静及免疫作用;金银花为佐药,有广谱抗菌作用,以助清热解毒,宣肺化痰;连翘为使药,具有升浮宣散之力。痰热清可用具有抗病毒、抑菌、抗炎、解热、化痰、镇咳等作用,广泛应用于呼吸、消化、血液等系统疾病 。除此之外,痰热清在不断的临床应用中，发展了许多临床新用途，应用范围不断扩大，在治疗急性胆囊炎，胰腺炎，川崎病，急性脑出血，开胸术后痰潴留，癌性发热，肾综合征出血热，多器官功能衰竭综合征，肺心病等各科疾病中均报道有良好疗效[7-9]。

近几年随着痰热清在心血管内科的疗效也不断得到证实，本文作者在心内科进行临床疗效观察的同时，也试图从动物实验阐释痰热清的心脏保护作用。本文作者的研究参考了已有学者证实的痰热清在急性肺损伤中发挥的调节免疫，抗氧化应激，抑制炎症反应，抑制细胞凋亡作用[10-11]，并且冠心病也主要是冠状动脉形成心梗斑块，致管腔狭窄冠脉血流量减少后心肌缺血所致，其形成机制复杂，氧化应激和/或炎症均与心梗相关，推测痰热清在急性心梗中亦可能发挥类似药效。既往动物实验显示，痰热清注射液可减少炎症反应及超敏反应等损伤性反应的发生，提高抗炎因子的表达[12]。可促进机体免疫功能发挥，对T、B 淋巴细胞增殖及腹腔巨噬细胞的吞噬功能具有显著促进作用[13]。同时还可降低炎性细胞因子的含量，保护血管内皮细胞的形态和功能[3]。临床研究结果表明，痰热清注射液能显著改善心梗的临床症状及动态心电图，有效地降低其血浆中hs-CRP 水平，对痰热型心梗患者具有显著的治疗作用，推测其作用机制可能是通过抑制体内炎症反应、抗氧自由基作用、增强机体免疫调节功能等途径，有效地改善血管内皮功能、稳定动脉粥样硬化斑块、降低斑块的破裂及血栓形成而达到抑止或延缓心梗发生发展的效果[2]。

本文的实验首先从心肌组织病理形态学改变上验证了小鼠梗死边缘区心肌纤维排列紊乱、断裂，肌浆嗜酸性增强；心肌细胞结构不清，呈凝固性坏死；心肌间质可见较多炎症细胞浸润及炎症性充血，痰热清与黄芩苷改善心肌细胞变性、坏死及炎症细胞浸润，同时降低梗死边缘区的心肌细胞凋亡率和梗死区面积，下调HMGB1/TLR4/NF-kB信号通路的表达。对于炎症反应的初始触发信号的探索中，人们发现了“危险信号”模式。相对于病原体基本成分或产物这类外源性的“危险信号分子”而言，内源性的“危险信号分子”来自损伤或坏死的细胞，一旦被释放到胞外，则是一种强大的致炎及趋化细胞因子。对这种内源性“危险信号分子”如何导致炎症反应失衡及免疫反应紊乱的研究是目前国际上的前沿热点[14]。HMGB1即是其典型代表，为广泛存于在有核细胞胞内均高度保守的DNA结合蛋白，具有稳定核酸结构、调节转录和基因表达等多种功能。长期以来人们对于HMGB1核外功能了解甚少。近年来研究发现，HMGB1是机体识别损伤、启动修复的非常重要的内源性“危险信号分子”。在实质细胞坏死的动物脑、肝脏和心脏等缺血模型中的研究显示，缺血发生早期，HMGB1即向胞外释放，应用HMGB1抗体可以减轻缺血再灌注损伤的程度[15]。本文推测在急性心梗的早期，缺血导致HMGB1释放，HMGB1通过巨噬细胞表面TLR4受体调节的NF-kB分泌，参与了心梗的发生发展[16]。围绕HMGB1/TLR4/NF-kB信号途径进行药物干预，能减轻心肌缺血带来的心肌细胞损伤，为急性心梗的治疗策略提供新的理论依据参考。

本文结果显示痰热清可能是通过抗氧化应激和抑制炎性因子的机制减少斑块发生，抑制心肌细胞凋亡，发挥了心脏保护作用，其主要信号通路与HMGB1/TLR4/NF-kB相关。HMGB1与TLR4结合后受体发生二聚化，引起MyD88和MyD88依赖性NF-kB的激活，上调炎性因子TNF-α、IL-6的基因表达水平并引起大量释放[17]。报道亦证实心肌组织缺血再灌注引起病理损伤，导致心肌组织MDA含量上升，凋亡增多，caspase-3上升，与HMGB1的上升呈同步相关性[18]。

综上所述，痰热清对小鼠心肌梗死后心肌细胞具有保护作用，具体机制涉及对HMGB1/TLR4/NF-kB信号通路的调节以及炎性因子，氧化应激及凋亡因子等多方面机制，黄芩苷是痰热清心脏保护作用的药效成分之一。

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ProtectiveeffectsofTan-Re-Qinganditsabsorbedcomponentsbaicalinonmyocardialcellinjuryaftermyocardialinfarctioninmice

YING Zi,HUANG Bin,KUANG XiBin

(DepartmentofPharmacology,theSecondAffiliatedHospital,UniversityofSouthChina,Hengyang421001,Hunan,China)

ObjectiveTo investigate the protective effect of Tan-Re-Qing and its main absorption component,baicalin,on myocardial cell injury after myocardial infarction in mice.MethodsC57BL/6 mice were randomly divided into sham operation group,myocardial infarction model group,high,medium and low dose of Tan-Re-Qing group,and baicalin 100 mg/kg contents in high dose group Tan-Re-Qing as absorbed compounds group.24 h myocardial pathology,the number of myocardial infarct size and apoptosis ratio,expression of HMGB1,TLR4 and NF-kB activity,level of IL-6,TNF-α,MDA,caspase-3 were measured and the results were statistically analyzed.ResultsCompared with myocardial infarction model group,Tan-Re-Qing and its absorbed compound baicalin could significantly improve myocardial pathology,reduced infarct marginal zone and cell apoptosis rate of myocardial infarction area,down-regulated the HMGB1/TLR4/NF-kB signaling pathway and the expression of IL-6,TNF-α,MDA,caspase-3.ConclusionTan-Re-Qing and its absorbed compound baicalin has similar heart protection effect,its mechanism relates to the improvement of HMGB1/TLR4/NF-kB signaling pathway and expression of their downstream inflammatory factors,oxidative stress and apoptosis factors,thereby reducing myocardial cell injury after myocardial infarction in mice.

Tan-Re-Qing; baicalin; myocardial infarction; apoptosis

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.06.008

2017-07-04；

2017-09-26

湖南省自然科学基金(院校联合基金项目)；痰热清吸收成分通过抗氧化途径发挥心脏保护作用的机理研究，基金号：2015JJ6099.

*通讯作者，E-mail：nanhuayingzi@163.com.

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蒋湘莲)