蛞蝓有效提取物抑制宫颈癌HeLa细胞裸鼠移植瘤生长

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(1.南华大学附属第二医院临床药学科，湖南 衡阳 421001；2.湖南师范大学医学院；3.南华大学药学与生命科学院；4.南华大学附属第二医院药剂科；5.南华大学附属第二医院重症医学科)

·基础医学·

蛞蝓有效提取物抑制宫颈癌HeLa细胞裸鼠移植瘤生长

王娟1，曹建国2，姚旭3，秦勇4，刘毅4，郑自通4，申文娟5*

(1.南华大学附属第二医院临床药学科，湖南 衡阳 421001；2.湖南师范大学医学院；3.南华大学药学与生命科学院；4.南华大学附属第二医院药剂科；5.南华大学附属第二医院重症医学科)

目的观察蛞蝓有效提取物(EL-3)对宫颈癌HeLa细胞裸鼠移植瘤生长的影响。方法制备宫颈癌HeLa细胞裸鼠移植瘤模型，检查EL-3对瘤体积、瘤重及VEGF蛋白表达的影响，评估EL-3在体内治疗宫颈癌的有效性。结果EL-3(10、30和100 mg/kg)实验组的瘤体积显著低于生理盐水组(P<0.05)，同时，其移植瘤的瘤重抑制率分别为42.0%、67.0%和83.0%，提示EL-3在体内抗宫颈癌作用较强，且呈剂量依赖性；采用免疫组化检测证实EL-3下调宫颈癌裸鼠移植瘤细胞VEGF蛋白表达。结论EL-3具有抑制宫颈癌HeLa细胞裸鼠移植瘤生长的作用，其机理可能与抑制肿瘤血管生成有关。

宫颈癌； 蛞蝓； 蛞蝓有效提取物； HeLa细胞 ； 治疗作用

蛞蝓(Agriolimax agrestis Linnaeus，Limax)为有肺的软体动物，属腹足纲，柄眼目，蛞蝓科，我国各地有产。因其体表布满黏液，形似蜗牛而无壳，故又俗称“黏虫、鼻涕虫”[1]。蛞蝓具有多种生物学活性和药理学效应，其中以抗肿瘤作用最为突出[2]。曾振东等人研究发现蛞蝓对小鼠S180肉瘤具有抑制作用[3]。本课题组研究蛞蝓的抗肿瘤作用，也有一定前期工作基础[4]。本文作者已应用现代药物化学技术，以鲜蛞蝓匀浆，60%乙醇沉淀，三氯乙酸脱蛋白获得蛞蝓有效提取物(extraction of limax-3,EL-3)，并通过实验证实EL-3具有抑制A549细胞锚定生长和增殖、诱导A549细胞凋亡以及体内抗肺癌的作用[5]。

宫颈癌是一种妇科常见恶性肿瘤，对女性健康安全威胁极大。清华大学药物研究所王钊等[6]人发现蛞蝓提取物对人宫颈癌HeLa细胞体外生长具有明显抑制作用。本研究拟用实验进一步观察蛞蝓有效提取物EL-3对宫颈癌HeLa细胞裸鼠移植瘤生长的影响。评估 EL-3在体内治疗宫颈癌的有效性，并对其可能的机制进行初步探讨，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1动物SPF 级 BALB/C 裸鼠，年龄4～5周，雌性，重量约18～20 g左右，由上海斯莱克景达实验动物有限公司提供，饲养于屏障环境 (百级无菌室)中。

1.2细胞宫颈癌HeLa细胞从中科院上海细胞生物研究所购买，用含10%小牛血清RPMI1640培养液，置37 ℃，5%CO2培养箱培养，常规传代，取对数生长期细胞进行实验。

1.3药物及试剂蛞蝓有效提取物EL-3，性状为淡黄色粉末状，由浙江工业大学生物环境工程学院多糖研究室提供。注射用顺铂(cisplatin,DDP)，齐鲁制药有限公司生产，规格：10mg/瓶，批号：7C0081B02。紫杉醇注射液(paclitaxell,TAX)，海口市制药厂有限公司生产，规格：30 mg/5 mL/支，批号：12161105。以上药物置于4 ℃ 冰箱中保存，用时以生理盐水稀释成所需浓度。DAB 免疫组化染色试剂盒及兔抗人VEGF多克隆抗体由美国Santa Cruz公司生产，购于上海研卉生物科技有限公司。

1.4称量器具美耐特牌电子数显游标卡尺，上海美耐特实业有限公司生产，型号：150T，测量范围：0～150 mm，分辨率：0.01 mm，误差值：±0.02 mm。上海卓精电子分析天平，上海卓精电子科技有限公司生产，型号：BSM-120.4，分度值0.1 mg，量程120 g，秤盘尺寸φ90 mm。凯丰高精密动物电子秤，凯丰集团有限公司生产，分度值0.01 g，最大称量300 g，秤盘尺寸φ115 mm。

1.6移植瘤免疫组织化学观察移植瘤免疫组织化学观察在显微镜下进行，观察前需要进行7步准备工作：①固定(将移植瘤组织放置于10 %的中性福尔马林中24 h)；②脱水；③常规石蜡包埋；④切片；⑤染色(用兔抗人VEGF多克隆抗体进行染色)；⑥显色(用 DAB 免疫组化染色试剂盒进行显色)；⑦复染(用苏木素复染1 min后水洗)。在400倍显微镜下对经过处理的组织切片进行观察，胞核或者胞浆呈棕色则为阳性细胞。对于显微镜观察得到的图片，采用Image Pro Plus 6.0专业图像分析软件进行定量分析，测量免疫组化结果中阳性细胞的积分光密度(integrated optical density，IOD)。积分光密度是表示整个视野内所有选定对象的反应强度的总和。在本文中，阳性细胞的积分光密度=平均光密度×阳性细胞的面积，积分光密度值越高，阳性细胞的反应强度越大，其蛋白含量越高。

2 结 果

2.1 EL-3对宫颈癌HeLa细胞裸鼠异种移植瘤生长的影响本文成功地建立宫颈癌HeLa细胞裸鼠异种移植瘤模型。在实验期间，EL-3实验组的裸鼠体重较对照组无明显差异，无裸鼠死亡。图1A和 图1B可见：高(EL-3 100 mg/kg)、中(EL-3 30 mg/kg)、低(EL-3 10 mg/kg)剂量组的移植瘤显著小于生理盐水模型对照组，各用药组瘤体积明显小于生理盐水组(P<0.05)(图2)，100、30和10 mg/kg的EL-3对移植瘤的瘤重抑制率分别为：83.0%、67.0%和42.0%，而同一实验条件下10 mg/kg的紫杉醇和2 mg/kg的顺铂对宫颈癌HeLa细胞裸鼠移植瘤的瘤重抑制率分别为93.0%和84.0%(表1)。以上结果显示：EL-3显著抑制HeLa细胞裸鼠移植瘤的生长，呈剂量依赖性。

图1 EL-3对宫颈癌HeLa细胞裸鼠移植瘤大体形态的影响A’:裸鼠处死大体观； B’:皮下移植瘤大体观. A：生理盐水对照组；B：TAX对照组；C：DDP对照组；D：EL-3 100 mg/kg 组；E：EL-3 30 mg/kg组；F：EL-3 10 mg/kg 组

图2 EL-3对宫颈癌HeLa细胞裸鼠移植瘤生长的影响(n=5)与生理盐水对照组比较，**P<0.01

组别瘤重(mg)瘤重抑制率(%)生理盐水对照组392±103—TAX对照组28±1793.0aDDP对照组61±3884.0aEL-3100mg/kg组66±1383.0aEL-330mg/kg组127±6667.0aEL-310mg/kg组226±7842.0b

与生理盐水对照组比较,a：P<0.01,b：P<0.05

2.2 EL-3对宫颈癌HeLa细胞裸鼠移植瘤VEGF表达的影响本文采用兔抗人VEGF多克隆抗体检测移植瘤细胞中VEGF蛋白的表达。生理盐水对照组中的大部分细胞核及胞浆呈棕黄色颗粒状，VEGF呈强阳性表达(图3A)；紫杉醇对照组中VEGF呈阴性表达(图3B)；顺铂对照组，小部分瘤细胞核着色，呈黄色，VEGF呈弱阳性表达(图3C)；高剂量EL-3实验组，小部分瘤细胞核着色，呈黄色，VEGF呈弱阳性表达(图3D)；中剂量EL-3实验组，部分瘤细胞核着色，呈黄色，VEGF呈中等阳性表达(图3E)。低剂量EL-3实验组，较大部分瘤细胞核着色呈黄色，VEGF呈较强阳性表达(图3F)。以上结果显示EL-3具有抑制宫颈癌裸鼠移植瘤细胞VEGF蛋白表达的作用。从图3G中可以看出，高、中、低EL-3剂量组裸鼠移植瘤细胞中的IOD值较生理盐水组的IOD值有明显降低，并呈剂量依赖性。

3 讨 论

宫颈癌是全球妇女最常见的恶性肿瘤之一[8]。宫颈癌的治疗以手术和放化疗为主，但对于宫颈癌晚期和复发的患者，则主要采用化疗。目前，宫颈癌新辅助化疗中常用的药物包括：顺铂、异环磷酰胺、紫杉醇、卡铂、氟尿嘧啶、丝裂霉素等。这些药物单独使用的有效率在6%～30%之间，并且存在严重化疗毒副反应，联合用药毒副反应更大，通常在临床治疗中需严格限制其使用剂量[9]。因此，寻找和研制新的高效、低毒、不良反应小的宫颈癌治疗药物，具有重大的社会、经济效益和广阔的临床应用前景[10]。

临床使用中药抗肿瘤历史悠久，主要是依据传统中医调节脏腑功能失调的理论进行治疗，存在实际应用中可操作性不强的缺点。同时，中药抗肿瘤最主要的问题在于发挥抗肿瘤疗效的有效成分尚不明确。但随着现代医学生物学和药学不断发展，中药的抗肿瘤研究已逐步深入到其有效部位或(和)活性成分对肿瘤细胞和肿瘤动物移植瘤模型作用的研究层次。因此，从天然动、植物或(和)中草药中寻找能相对选择性地抑制或杀灭肿瘤细胞、毒副作用较小的有效部位或(和)活性药物分子具有重要科学意义。

图3 EL-3抑制宫颈癌裸鼠移植瘤细胞VEGF表达 光学显微镜(400×)A：生理盐水对照组；B：TAX对照组；C：DDP对照组；D：EL-3 100 mg/kg组；E：EL-3 30 mg/kg组；F：EL-3 10 mg/kg组G:EL-3剂量依赖性降低宫颈癌裸鼠移植瘤细胞VEGF表达(n=5) . 与生理盐水对照组比较，*：P<0.05

蛞蝓作为传统中药，被国内外多项研究证实其具有抗肿瘤作用，它与常规化疗药物相比，疗效相当，并具有低毒及协同常规化疗药物抗肿瘤等特点[11]。因此，近年来蛞蝓的抗肿瘤作用引起了广大医药科研工作者的重视。焦智民等[12]人观察了以蛞蝓为主综合治疗中晚期肺癌患者的疗效，治疗组采用以蛞蝓胶囊为主加中医辩证施治及联合化疗的综合治疗，总有效率为62.5%，明显高于应用中医辩证施治及联合化疗的对照1组的有效率39.1%和只用联合化疗的对照2组的有效率30.1%。本前期实验亦发现蛞蝓提取物能有效地抑制 A549 细胞BrdU的掺入以及诱导A549细胞凋亡、亚G1期细胞累积和基因 DNA 的非随机性剪切，此外还发现蛞蝓提取物对A549细胞移植瘤生长具有抑制作用，且呈剂量依赖性[13]。

王钊等[6]人通过体外实验发现蛞蝓提取物对人宫颈癌HeLa细胞的生长具有明显抑制作用。本研究则通过建立宫颈癌HeLa细胞裸鼠移植瘤模型开展治疗实验，进一步验证了蛞蝓有效提取物EL-3体内治疗宫颈癌的效果，并通过免疫组织化学观察，分析EL-3对宫颈癌HeLa细胞裸鼠移植瘤VEGF表达的影响。实验结果证实EL-3能有效地抑制HeLa细胞裸鼠移植瘤生长，它通过下调VEGF蛋白表达，从而发挥体内抗肿瘤作用，作用机制可能与其抑制肿瘤血管生成有关。

综上所述，蛞蝓有效提取物EL-3具有较强抗宫颈癌作用，毒副作用小是其优于当前常用化疗药物的突出特点，因而具有潜在临床应用价值。本文也为将EL-3开发和研制成治疗宫颈癌的创新型药物提供了实验依据，然而对于其抗宫颈癌作用的分子机制还需要继续深入探索。

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InhibitoryeffectsoflimaxeffectiveextractiononthegrowthofcervicalcancerHeLacellstransplantedtumorinnudemice

WANG Juan,CAO Jianguo,YAO Xu,et al

(DepartmentofClinicalPharmacy,theSecondAffiliatedHospital,UniversityofSouthChina,Hengyang421001,Hunan,China)

ObjectiveTo determine the effect of EL-3,an effective extraction of limax,on the growth of cervical cancer HeLa cell xenografts in nude mice.MethodsThe model of cervical cancer HeLa cells in nude mice was established,and the effect of EL-3 on the tumor volume,tumor weight and the expression of VEGF protein were examined.The effectiveness of EL-3 in the treatment of cervical cancer in vivo was evaluated.ResultsEL-3 can effectively inhibit the growth of human cervical cancer transplanted tumor in nude mice;tumor volume of 10,30,100 mg/kg dose group of EL-3 were significantly lower than that of normal saline group (P<0.05);simultaneously,the transplanted tumor weight inhibitory rates were 42%,67% and 83% respectively,suggesting that the effect of EL-3 in vivo against cervical cancer is stronger and in a dose-dependent manner.Immunohistochemistry showed that EL-3 could down regulate the expression of VEGF protein of the transplanted tumor tissues of cervical cancer HeLa cells in nude mice.ConclusionEL-3 can inhibit the tumor growth of cervical cancer HeLa cells in nude mice,and the mechanism may be related to the inhibition of tumor angiogenesis.

cervical cancer; limax; effective extraction of limax; HeLa cells; therapeutical effect

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.06.007

2017-06-29；

2017-09-28

湖南省教育厅科学研究项目(16C1407)；广州市科技计划项目(2003Z3-E5131)；衡阳市科技计划项目(2016KJ60).

*通讯作者，E-mail:278028342@qq.com.

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