弥漫大B细胞淋巴瘤中MYC和BCL-2蛋白共表达的临床病理意义

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(1.广州市花都区人民医院病理科，广东 广州510800；2.广州医科大学附属第二医院病理科)

·临床医学·

弥漫大B细胞淋巴瘤中MYC和BCL-2蛋白共表达的临床病理意义

胡名娟1*，李国伟1，欧阳小明2

(1.广州市花都区人民医院病理科，广东 广州510800；2.广州医科大学附属第二医院病理科)

目的检测弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)中MYC和BCL-2蛋白表达状况，探讨MYC/BCL-2共表达在DLBCL中的临床意义和预后评估价值。方法回顾性分析76例确诊并采用利妥昔单抗初治的非特指型DLBCL病例的Ann Arbor分期、标准国际预后指数评分(IPI)、免疫组化Hans分型和临床疗效等临床病理参数，采用免疫组化EnVision二步法检测MYC和BCL-2蛋白表达状态，并分析其与患者临床病理特征的关系。结果76例DLBCL组织中，MYC阳性表达55例(72.4%)，BCL-2阳性表达41例(53.9%)，MYC与BCL-2共表达者33例(43.4%)。MYC/BCL-2共表达者Ann Arbor分期中高分期者比例显著增高，且临床治疗未缓解者明显增多(P<0.05)。但与Hans分型和原发部位等因素均无相关性。标准IPI评分与DLBCL所有临床病理特征均无联系。结论MYC/BCL-2共表达可能是DLBCL的特殊免疫组化表型，作为标准IPI预后评分的补充，对利妥昔单抗初治DLBCL患者预后判断具有一定价值。

弥漫大B细胞淋巴瘤； MYC蛋白； BCL-2蛋白； 预后

弥漫大B细胞性淋巴瘤(Diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)是最常见的非霍奇金淋巴瘤类型，由于存在组织学亚型、免疫表型和遗传学基因表型的差异，DLBCL在临床病理特征和预后等方面都表现出高度的异质性[1]。最近，“双打击”B细胞淋巴瘤(double-hit lymphoma)逐渐被临床和研究者重视，这是一种MYC和 BCL-2或BCL-6基因重排的特殊表型，可发生于6%～13%的B细胞淋巴瘤中[2-3]，但MYC和BCL-2蛋白在肿瘤中的“共表达”却高达29%～45%[4]，而这一特殊免疫表型与DLBCL的临床预后关系尚不完全明确。本文即通过免疫组化法检测MYC和BCL-2蛋白的共表达状态，并与患者的临床病理学特征相联系，探讨MYC/BCL-2共表达与DLBCL预后的关系。

1 资料与方法

1.1标本收集收集2013年1月～2016年6月广州市花都区人民医院及广州医科大学附属第二医院病理科收治有明确诊断的非特指型DLBCL(DLBCL,NOS)标本76例，所有病例均由2位病理医师根据2008年世界卫生组织(WHO)淋巴造血系统肿瘤分类诊断标准诊断[1]或回顾性复习阅片，均获得相同的诊断结果。所有患者均经R-CHOP方案作为初治方案，以Ann Arbor分期为标准进行分期，并进行标准国际预后指数(the international prognostic index score，IPI)评分。所有患者均经知情同意并签署知情同意书，本研究经本院医学伦理会审核批准。

1.2一般资料收集的76例非特指型DLBCL病例中男性44例，女性32例，年龄22～68岁，中位年龄53岁，大于60岁患者44例(57.9%)，小于60岁患者32例(42.1%)。53例患者(69.8%)原发于淋巴结内；23例原发于淋巴结外(30.2%)，其中1例原发于骨，甲状腺1例，16例原发于胃肠道，2例原发于睾丸，1例原发于卵巢，2例原发于皮肤。Ann Arbor分期I～II期者27例(35.5%)，III～IV期者49例(64.5%)。IPI评分1～2分(低危险度)者28例(36.8%)，3～5分(中—高危险度)者48例(63.2%)。Hans分型GCB型31例(40.8%)，non-GCB型45例(59.2%)。

1.3免疫组织化学染色及评判标准所有石蜡包埋病理标本均经4%中性福尔马林固定，常规HE染色组织学观察。采用EnVision 二步法进行免疫组织化学染色。检测标记物包括：MYC、BCL-2、CD10、BCL-6、MUM-1和Ki-67。第一抗体均购自Dako公司和福州迈新公司。4 μm厚度切片经脱蜡水化和抗原修复后，滴加一抗，放入37 ℃水浴箱孵育 60 min，PBS冲洗后按照采用EnVision检测试剂盒说明书进行，室温孵育 30 min，再次PBS 冲洗，DAB显色，苏木精复染，然后脱水、透明、封片，每例均设阳性和阴性对照。MYC、BCL-6和Ki-67表达于细胞核，BCL-2和CD10表达于细胞质。所有染色切片均由2位病理医师双盲法阅片，每张切片计数≥500个细胞。MYC阳性细胞比例≥50%、BCL-2阳性细胞比例≥30%判断为阳性表达[5]；CD10、BCL-6和MUM-1染色结果用于DLBCL的Hans分型，阳性细胞比例≥30%判断为染色阳性[6]。

1.4统计学分析采用 SPSS 14.0统计学软件进行数据分析，计数资料用百分率表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 MYC和BCL-2在DLBCL组织中表达76例DLBCL组织中，MYC阳性表达55例(72.4%)(图1C)，BCL-2阳性表达41例(53.9%)(图1D)，MYC与BCL-2共表达者33例(43.4%)。表1显示了MYC/BCL-2共表达与患者临床病理特征的关系。MYC/BCL-2共表达者Ann Arbor分期中高分期者比例显著增高，且临床治疗未缓解者明显增多，差异均具有显著性(P<0.05)。Hans分型中non-GCB型比例略有增多，但差异无显著性(P=0.101)。年龄、性别以及原发部位等临床病理特征因素中差异均无显著性。

图1 CD20、MYC、BCL2在弥漫性大B细胞淋巴瘤组织中的表达(免疫组化Envision二步法， ×400)A：弥漫性大B细胞淋巴瘤HE染色；B：CD20在瘤细胞膜的表达；C：MYC在瘤细胞核的表达；D：BCL2在瘤细胞质的表达

例数MYC/BCL-2共表达非MYC/BCL-2共表达χ2值P值性别 男性4419250.0020.961 女性321418年龄(岁) ≥604417270.9730.324 <60321616IPI评分 低危险度2813150.1630.686 中—高危险度482028AnnArbor分期 Ⅰ～Ⅱ期2717106.5100.011 Ⅲ～Ⅳ期491633Ki-67指数 ≥70%4518270.5260.468 <70%311516Hans分型 GCB型3110212.6920.101 Non-GCB型452322原发部位 淋巴结内5320332.3040.129 淋巴结外231310临床治疗 未完全缓解2919109.3200.002 已完全缓解471433

2.2标准IPI评分与其它临床病理特征之间的联系为了验证标准IPI在利妥昔单抗治疗患者中的预后评估作用，本研究分析了标准IPI与DLBCL患者的临床病理特征。结果如图2所示，标准IPI评分与DLBCL患者的主要临床病理特征指标均无相关性(P>0.05)。提示标准IPI评分对于利妥昔单抗治疗DLBCL患者的预后评估作用有限。

图2 标准IPI评分与利妥昔单抗初治DLBCL患者的临床病理特征关系

3 讨 论

目前DLBCL生物学行为高度异质性和临床预后评估指标还尚未确定。标准国际预后指数(IPI)评分由于综合了年龄、侵犯部位、疾病进展程度和肿瘤负荷等多项临床病理参数，一直认为是较好的DLBCL预后指标之一[7]。但临床采用利妥昔单抗(美罗华)后，标准IPI各分组之间的预后差异变小，不能很好地用于评估DLBCL患者预后，故对标准IPI评分进行修订，产生修订版IPI评分和NCCN-IPI评分[8]。本研究结果也表明，标准IPI评分确实不能影响利妥昔单抗治疗患者的缓解率。尽管由于缺乏确切的随访资料未能对患者进行1年和3年生存率比较，本研究结果仍提示标准IPI评分对临床疗效的预测作用并不理想，可能需要更多、更精确的预后参数参与评估。

“双打击”淋巴瘤(DHL)传统上是指同时存在MYC/8q24及其他基因位点易位的B细胞淋巴瘤，最常见的是BCL-2/18q21，但也是较少见BCL-6、CCND1和BACH2等基因[9]。由于MYC、BCL-2等基因异常影响DLBCL生物学行为，表现为患者预后极差，一线方案疗效有限和生存期明显缩短，故“双打击”淋巴瘤成为近年的研究热点。但是，通过基因方法检测遗传学“双打击”DLBCL在临床实践中的检出率并不高，只有约6%～13%[2-3]，而MYC/BCL-2共表达却可在29%～45%的病例中检出[4]。同时，对于一些缺乏基因检测方法的基层医院，免疫组化检测MYC/BCL-2共表达的方法更方便快捷，而且已有研究显示，MYC/BCL-2共表达的DLBCL患者预后较差[10]，而MYC/BCL-2非共表达者的总生存时间及无进展生存期延长[11]。因此，MYC/BCL-2的免疫组化检测对DLBCL患者的预后具有判断价值，也可能作为预后判断的分子标志物。Green等[2]通过免疫组化法检测发现MYC/BCL-2共表达者治疗后完全缓解率降低，3年生存期及无进展生存期均短于非共表达患者。因此提出“免疫组化双打击评分(Immunohistochemical double-hit score)”作为现行利妥昔单抗治疗DLBCL的预后补充评分体系，以发现那些疗效差和预后不良的病例。本研究结果显示MYC/BCL-2共表达比例为43.4%，且共表达者临床治疗完全缓解率低，与既往研究结果基本一致。本研究还显示，MYC/BCL-2共表达与标准IPI评分并无相关性。提示MYC/BCL-2共表达可能是独立于标准IPI评分之外的因素之一，它影响DLBCL预后并不依赖于肿瘤IPI评分特征。但是否能够作为DLBCL的独立影响因素则尚需要进一步研究明确，因为已有研究显示仍有相当数量的“非MYC/BCL-2共表达”患者通过标准R-CHOP方案能够达到满意疗效[12]，说明目前临床尚不能根据瘤细胞MYC/BCL-2共表达状况即对初治DLBCL调整为强度更大的治疗方案(如García-Suárez J等[13]EDOCH-R-2周方案)。

有研究显示MYC高表达与患者IPI评分存在相关性，提示MYC高表达是患者预后变差的标志之一[11]。但本研究结果并未得出这一结论，相似地国内杨海燕等[14]单因素生存分析也未发现MYC基因异常对患者整体生存有明显影响。由于MYC基因编码转录因子参与细胞生长、增殖、分化、凋亡等多个过程，与肿瘤发生发展密切相关，利妥昔单抗的应用并不能克服这一不良因素[4]，而诸多研究均显示标准IPI评分在利妥昔单抗治疗DLBCL患者的评估局限性[8]，故MYC/BCL-2共表达免疫组化表型可能代表一种DLBCL的特殊临床表型，其背后潜在的肿瘤细胞增殖、分化、黏附、侵袭等分子机制并非标准IPI评分能够完全解释。本研究结果显示Ann Arbor高分期者MYC/BCL-2共表达显著增高，也提示具有这一免疫表型的DLBCL有更强侵袭播散能力。较传统遗传学“双打击”淋巴瘤而言，MYC/BCL-2免疫组化共表达淋巴瘤扩大了侵袭性B细胞淋巴瘤的范围，有必要探索新的治疗方案和采用更有效的预后指标对这类病变进行治疗和监控。

Hans分型也是B细胞淋巴瘤常用以评估预后的危险因素之一，通过免疫组化CD10、Bcl-6和MUM-1三者的结果组合将DLBCL分为生发中心B细胞型(GCB型)和非GCB型(non-GCB型)。尽管多数研究认为GCB型较non-GCB型预后相对较好，但在临床实践中，两种类型的异质性较明显，也有部分non-GCB型预后好而GCB型预后很差[15]。MYC/BCL-2共表达与Hans分型的关系研究发现，MYC/BCL-2共表达在non-GCB型的DLBCL中比例更高[2]。但这一结果并不确定，本研究结果和国内杨帆等研究均未能得出这一结论[16]，其原因可能与病例样本数量较小有关。尽管单因素BCL-2蛋白表达是GCB及non-GCB患者的不良预后因素[17]，但更多的研究并不建议把DLBCL分成ABC和GCB或是免疫组化分型的GCB型和non-GCB型，因为联合MYC/BCL-2蛋白表达情况评估预后比细胞起源分类更有效[2，4]。

综上所述，本研究结果提示MYC/BCL-2共表达可能是DLBCL的特殊免疫组化表型，拓展了传统遗传学“双打击”淋巴瘤的范围，为利妥昔单抗初治DLBCL患者预后判断提供了更多依据，作为标准IPI预后评分的补充，对探索DLBCL新治疗方案提供明确的蛋白表型和分子靶点。

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TheclinicopathologicalsignificancesofMYCandBCL-2co-expressionindiffuselargeBcelllymphoma

HU Mingjuan，LI Guowei,OUYANG Xiaoming

(DepartmentofPathology，HuaduDistrictPeople’sHospitalofGuangzhouCity，Guangzhou510800，Guangdong，China)

ObjectiveTo assay the expression of MYC and BCL-2 proteins in diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL),and to investigate the clinicopathological significances of MYC/BCL-2 co-expression in DLBCL.MethodsArchived 76 DLBCL,NOS were collected and analyzed retrospectively.The clinicopathological characteristics,including Ann Arbor staging,the international prognostic index (IPI) score,Hans’s classification and therapeutic effects,were re-evaluated.The co-expression of MYC/BCL-2 was detected by immunohistochemical staining using EnVision detection system.ResultsMYC or BCL-2 expression could be detected in 55 cases (72.4%) and 41 cases (53.9%),respectively.The co-expression of MYC/BCL-2 was observed in 33 cases (43.4%).There was a close relationship found between co-expression of MYC/BCL-2 and higher Ann Arbor staging (P=0.011),or worse therapeutic effect of patient (P=0.002).However,co-expression of MYC/BCL-2 was not correlated to other clinicopathological features,such as tumor site and Hans’s classification.In addition,there was no correlation found among IPI score and all of clinicopathological features of DLBCL in this study.ConclusionsCo-expression of MYC/BCL-2 in tumor cells might be a specific immunohistochemical phenotype of DLBCL,and combined with standard IPI score,which might be a valuable prognostic factor for DLBCL patients with rituximab treatment.

Diffuse large B-cell lymphoma; MYC; BCL-2; prognosis

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.03.017

2016-12-09；

2017-04-28

*通讯作者，E-mail：694777171@qq.com.

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