三邻甲苯基磷酸酯的神经毒性研究进展

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(1.湖南环境生物职业技术学院，湖南 衡阳421001；2. 南华大学公共卫生学院)

·小专论·

三邻甲苯基磷酸酯的神经毒性研究进展

江岚1,2，龙鼎新2

(1.湖南环境生物职业技术学院，湖南 衡阳421001；2. 南华大学公共卫生学院)

三邻甲苯基磷酸酯(TOCP)是众多有机磷酸酯类化合物代表之一，有多器官毒性作用主要表现在对动物生殖毒性、免疫毒性和神经毒性。本文主要综述了TOCP分子理化特性、TOCP神经毒性作用的研究，并从骨架蛋白含量改变、氧化应激、细胞凋亡与细胞自噬等方面对TOCP神经毒性作用机制进行了综述。

三邻甲苯磷酸酯(TOCP)； 神经毒性； 有机磷酯类化合物诱发的迟发性神经毒性(OPIDN)

1 TOCP分子理化特性与用途

三邻甲苯基磷酸酯(tri-ortho-cresyl phosphate，TOCP)属于三甲苯磷酸酯的邻、对及间位3种异构体中的一种，三邻甲苯磷酸酯的分子式为C21H21O4P，分子量为368.36。分子结构数据如下：摩尔折射率为102.14，摩尔体积为306.6 m3/mol，等张比容(90.2 K)为793.2，表面张力为44.7 dyne/cm，极化率(10～24 cm3)为40.49。其分子结构如下(图1)。

图1 三邻甲苯磷酸酯结构式

常温下，TOCP是无味、微黄透明的液体。不溶于水，能溶于醇、醚、苯等有机溶剂。由于具有化学与热稳定性，可用作增塑剂，阻燃剂、软化剂使用，常用于塑料、橡胶、涂料及合成纤维等工业，也可作为机油添加剂与汽油中铅的净化剂等[1-2]。因此，TOCP在工业上及日常生活中TOCP用途极为广泛。

2 TOCP的神经毒性作用

关于TOCP的神经毒性，目前有三种不同的毒性结局：(1)抑制胆碱酯酶而诱发急性中毒；(2)短期或长期多次接触TOCP可以引起神经退行性综合症；(3)一次或多次接触TOCP引起的迟发性神经毒性(organophosphoms ester-induced delayed neurotoxieity，简称OPIDN)[2]。迟发性神经毒性是TOCP的神经毒性中最为常见的症状。早在20世纪30年代，美国有上万人因饮用污染了TOCP的牙买加姜汁酒发生瘫痪；随后南非和摩洛哥、斯里兰卡和印度等其他国家也出现因食用TOCP污染食用油而导致人群瘫痪的中毒事件[3]。我国自20世纪90年代初以来，在北京、西安和深圳等地也相继发生多起因食用污染TOCP面粉和食用油而导致同类事件[4]。由于TOCP能诱发迟发性神经毒素，造成以肢体远端运动障碍功能为主的周围神经脱髓鞘病变。该病可持续数十年，严重者能导致终生残疾，危害十分严重，人们对其的重视度逐渐提高。

3 TOCP神经毒性作用机制

3.1骨架蛋白含量改变TOCP处理后鸡大脑组织中神经丝含量变化比微管与微丝蛋白大，该变化可能与OPIDN有关。 研究表明，TOCP处理之后，鸡的脊髓神经细胞膜上的[3H]DFP(diisopropy-lfluorophosphate)结合量降低[5],而各段脊髓神经细胞膜之间[3H]DFP的结合量变化不大。推测TOCP先结合脊髓神经细胞膜上的特异性蛋白，由于特异性蛋白和[3H]DFP之间存在竞争，使[3H]DFP的结合受到抑制。随着TOCP处理后时间的增加，结合受体代谢了TOCP，从而结合受体的量变小，使[3H]DFP结合到空余的受体上，使[3H]DFP的结合量升高。TOCP和DFP都具有迟发性神经毒性，因此，脊髓神经细胞膜上的特异性位置可能与OPIDN相关。还发现，TOCP能致受试成年鸡细胞周期蛋白依赖性激酶5(cyclin-dependent kinase5,CDK5)异常磷酸化增强[6]。已知CDK5异常激活及其磷酸化与神经退行性疾病的发生密切相关，CDK5与其它一些激酶一起共同对多种细胞骨架蛋白磷酸化，在神经轴突生长过程中调节骨架蛋白之间的相互作用[7-8],TOCP处理的实验鸡的中枢及外周神经轴突中确实有磷酸化骨架蛋白的异常聚集。细胞骨架蛋白磷酸化增强导致细胞骨架成分的降解，既而引起顺行性轴浆运输加速，最终导致降解后的细胞骨架成分在轴突末梢部位的聚集[9]。TOCP处理成年鸡产生OPIDN，脊髓组织中NFs含量紊乱，预先用PMSF处理可阻断OPIDN，并可显著抑制脊髓NFs含量的紊乱[10]。

研究发现TOCP中毒可改变鸡神经组织中的微管相关蛋白2(microtubulin-associated protein 2,MAP-2)含量，可能与其迟发性神经毒性相关。MAP-2是成熟神经元树突的主要标志之一，已知微管是神经元细胞骨架的主要成分,在神经元正常结构和功能的维持中发挥重要作用[11]。TOCP处理是否直接损伤培养鸡少突胶质细胞，TOCP对少突胶质细胞有直接作用，能使其突起变性损伤，胞体出现空泡样变；推测少突胶质细胞损伤可能和OPIDN发病机制有关[12]。

3.2氧化应激研究表明，有机磷化合物能诱导机体氧化应激，生成活性氧，发生抗氧化反应[13-14]。TOCP作为一种有机磷酸酯类化合物，也能造成成年鸡神经组织出现脂质过氧化导致氧化应激。抗氧化系统失衡、脂质过氧化可能为TOCP引起OPIDN的一个重要机制。TOCP引起母鸡OPIDN中抗氧化系统和凋亡相关蛋白改变，随时间推移TOCP使母鸡神经组织与血清的脂质过氧化物增加，损伤其抗氧化防御系统；TOCP对坐骨神经影响较早、较敏感，坐骨神经脂质过氧化增强和抗氧化能力降低与其传导功能降低显著相关。随着时间的推移，成年鸡中枢神经组织中大脑与脊髓中Cyt-c蛋白的表达增加。体外实验证明，TOCP对人成神经瘤细胞SH-SY5Y存在着氧化损伤，氧化应激产生的活性氧可以引起蛋白质的氧化损伤和错误折叠，导致细胞内蛋白结构的变化。为了防止过多氧化修饰蛋白以及其它受损蛋白在细胞内集聚而产生细胞毒性，细胞会启动其保护机制—增加或加速异常蛋白的水解。研究表明，蛋白酶解系统在细胞对毒物或环境应激的应答等方面具有重要作用[15]。研究表明高浓度TOCP能显著增加泛素化蛋白的集聚，并呈现较明显的剂量效应关系。提示较高浓度的TOCP可致泛素蛋白酶体途径的阻断或抑制。

3.3细胞凋亡与细胞自噬有研究表明，TOCP诱发成年母鸡迟发性神经毒性过程中出现腰髓前角神经元细胞凋亡的现象，而且神经元凋亡发生在迟发性神经毒性症状出现之前，提示细胞凋亡可能在迟发性神经病发病机制中起重要作用[16]。Mou DL等[17]发现TOCP诱发的OPIDN中母鸡的脊髓神经元的损伤，电镜观察染毒第5天出现神经元的凋亡，均提示凋亡可能涉及OPIDN的发展。一些体外实验发现,TOCP可明显影响SH-SY5Y细胞的存活，并且具有浓度及时间效应关系，显示TOCP能导致细胞死亡，但经流式细胞仪检测，TOCP处理的SH-SY5Y细胞在其细胞周期直方图上并未出现典型的亚二倍体凋亡峰，另外，凋亡促进基因P53在mRNA水平和蛋白水平均未见表达增强[18]。以上结果提示TOCP诱导的细胞死亡并非凋亡，有可能是程序性细胞死亡的另一种形式—自噬性细胞死亡。

自噬(autophagy)是近年来新发现的程序性细胞死亡方式，称为Ⅱ型程序性细胞死亡。自噬与人类多种神经退行性疾病有关，如在帕金森病、阿尔茨海默病和亨廷顿病等神经退行性疾病中可发现自噬体的积聚[19]。维持生理水平的自噬对神经细胞的健康和功能的发挥至关重要；而自噬的紊乱(自噬缺失或过度)则可导致神经突起的退行性病变及神经细胞死亡。本文作者发现 TOCP可导致SH-SY5Y细胞自噬性死亡，并且TOCP处理浓度与自噬发生呈正相关，TOCP导致骨架蛋白的降解方式包括自噬。在TOCP诱发成年鸡的OPIDN中，脊髓、坐骨神经的自噬相关蛋白LC3的表达呈时间效应关系，随着染毒时间的延长，OPIDN症状越明显，蛋白表达增多，说明自噬与OP导致的OPIDN存在密切的联系。TOCP染毒造成成年鸡脊髓和胫神经里面的beclin-1含量明显降低，但是u-calpain含量增加显著。经过PMSF预处理在将TOCP造成的OPIDN的同时，可以显著抑制TOCP引起的beclin降低和u-calpain含量的升高，推断TOCP是神经元中的自噬调节机制[20]。

4 展 望

随着科学技术的高速发展，TOCP方面的研究也逐渐从形态表现、生理生化性状向分子生物学发展，其神经毒性机制也日益深化。而关于其解毒机制方面的研究却少见报道，相信这方面会成为将来的研究热点。TOCP神经毒性研究属于一项综合性的系统课题，涉及医药学、病理学、毒理学、动物学、分子生物学等诸多学科，需要多学科的专家进行整合研究，因此，多学科的交叉融合或许是将来的一个研究方向。

[1] Craig PH,Barth ML. Evaluation of the hazards of industrial exposure to tricresyl phosphate:a review and interpretation of the literature[J]. J Toxicol,1999,2(11) :281-300.

[2] Winder C,Balouet JC. The toxicity of commercial jet oils[J]. Environ Res,2002,89(2):146-164.

[3] Nanda,Tapaswi PK.Biochemical,neuropathological and behavioral studies in hens induced by acute exposure of tri-ortho-cresyl phosphate[J].Int J Neurosci,1995，82(3-4):243-254.

[4] 王秀芹,谭琳,陈匙生,等.亚急性磷酸三邻甲苯酯中毒10例临床分析[J].中国职业医 学,2003,30(3):68-69.

[5] Guhekin F. The effect of organophosphate insecticide chlorpyrifos-ethyl on lipid peroxidation and antioxidant enzymes (in vitro)[J]． Arch Toxieol,2014,74:533.

[6] Wang YP,Mou DL,Song JF,et al.Aberrant avtivation of CDK5 is involved in the pathogenesis of OPIND[J].Neurocjem，2006,99(1):186-197.

[7] Smith DS,TsaiLH.Cdk5 Behind the wheel:a role in traffcking and transport[J].Trends Cell Biol，2002,12,28-36.

[8] Cruz JC,TsengHC,GoldmanJA,et al.Aberrant CDK5 activation by p25 triggers pathological events leading to neurodedeneration and neuro brillary tangles[J].Neuron,2003,40,471-483.

[9] Abou-Donia MB,Lapadula DM.Mechanisms of organophosphorus ester-induced delayed neurotoxicity[J].Toxicol,1990,40:405-440.

[10] Gupta R C. Depletion of energy metabolites following acetyl-cholineasterase inhibitor-induced status epilepticus：protection by antioxidants[J]． Neurotoxicology,2016,22:271-282.

[11] 韩晓英,程东,赵秀兰,等.TOCP诱发OPIDN后鸡神经组织MAP-2的变化[J].毒理学杂志，2005,19(1):23-25.

[12] 吴守芝,曹荣,宋俊峰.磷酸三邻甲苯酯诱导少突胶质细胞空泡样变及突起变性损伤[J].中华劳动卫生职业病杂志，2007,11(5):267-270.

[13] Hou WY,Lng DX,Wu YJ. The homeostasis of phosphatidylcholine and lysoph0sphatidylcho line in nervous tissues of mice was not disrupted after administration of tri-ortho-cresyl phosphate[J]. Toxicol Sci,2009,109(2):276-285.

[14] 龙鼎新,伍一军,蒋伟. TOCP 对人成神经瘤细胞 SH-SY5Y 的氧化损伤作用[J]. 中南医学科学杂志,2011,39(3):266-269.

[15] Hershko A,Ciechanover A.The ubiquitin system[J].Annu Rev Biochem,1998，67:425-479.

[16] 宋福永,寇蕊蕊,韩晓英,等. 三邻甲苯磷酸酯诱导的母鸡神经组织中beclin和u-calpain的 变化[J].中国科技论文在线,2012,1-6.

[17] Wu YJ,Li M,Li YX,et al. Verapamil abolished the enhancement of protein phosphorylation of brainstem mitochondria and synaptosomes from the hens dosed with tri-ortho-cresyl phosphate[J].Environ Toxicol Pharmacol,2007,24(1):67-71.

[18] Long DX,Wu YJ.Growth inhibition and induction of G(1) phase cell cycle arrest in neuroblasto-ma SH-SY5Y cell by tri-ortho-cresyl phosphate[J].Toxicol.Lett,2008,181(1):47-52.

[19] Liu Z,Lenardo MJ. Reactive oxygen species regulate autophagy through redox-sensitive proteases[J]. Dev Cell,2015,12(4):484-485.

[20] Damodaran TV,Abdel-Rahman A,Elsourady MH,et al.Differential alteration of glyceraldehy-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)mRNA in the central nervous system of hens hens treate with diisopropylphosphorofluoridate (DFP)[J]. Neurochem Int,2015,40(4):371-379.

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.05.026

2016-09-17；

2017-07-28

国家自然科学基金项目(81172712)；湖南省自然科学基金项目(11JJ6078)； 湖南省教育厅优秀青年基金项目(09B087)；南华大学博士启动基金项目(2010XQD19).

*通讯作者，E-mail:dxlong99@163.com.

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