西瓜花药培养的若干影响因素

王文英，刘喜存，马晓红，郭春江，董彦琪

（河南省新乡市农业科学院 河南新乡 453000）

西瓜花药培养的若干影响因素

王文英，刘喜存，马晓红，郭春江，董彦琪

（河南省新乡市农业科学院 河南新乡 453000）

为了探索西瓜花药培养的最佳取材时期、热激处理时间及培养基激素配方，通过花蕾分级、设置不同的热激处理时间、不同诱导培养基，观察分析愈伤组织生长情况。结果表明，当花蕾和花药处于中等大小时，为‘新蜜一号’花药接种的适宜时期；西瓜花药在33℃的高温条件进行处理3 d，再置于25℃条件下暗培养至14 d能激发花药产生愈伤组织。诱导培养基的激素配比为1.0 mg·L-16-BA+0.4 mg·L-1NAA和1.5 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA时，愈伤组织诱导率较高。

西瓜；花药培养；花蕾形态；高温预处理；诱导培养基

西瓜[Citrullus lanatus(Thunb.)Matsum.&Nakai]是人们喜爱的葫芦科作物之一，也是重要的经济作物之一。传统西瓜育种需连续自交多代才能获得100%纯系，这个过程需要耗费大量时间和物力。相对于传统育种，生物技术育种也能创造纯系，且便捷、高效，因此大大提高育种效率，缩短育种年限。前人研究表明，通过花粉辐射和离体胚挽救技术[1-2]、未授粉子房/胚珠培养技术[3-4]和花药培养技术[5-8]均可获得单倍体胚和植株。然而，影响单倍体诱导途径的因素很多，如基因型、生长环境、外植体发育阶段、诱导培养基成分、低温预处理时间、热激处理时间等[9-10]，但这些影响因素研究尚不透彻，致使胚诱导率低、植株分化率低。荣文娟等[4]以西瓜未受精胚珠为外植体的研究结果表明，不同基因型的胚珠反应率和愈伤诱导率都有显著差异，35℃高温预处理3 d可得到较高愈伤诱导率的质量较好的愈伤组织，在诱导培养基MS+2 mg·L-16-BA+3 mg·L-1NAA+0.05 mg·L-1TDZ 上，愈伤诱导率最高，为84.36%。魏跃等[11]试验发现，不同品种对激素变化的反应也不同，有的较为敏感，有的较为迟钝，激素6-BA对诱导率的影响一般要大于NAA，在愈伤组织诱导中，6-BA浓度是关键。笔者在探索花药培养过程中，研究了花蕾形态指标、热激处理时间及添加不同激素的诱导培养基对西瓜花药培养的影响，为西瓜花药培养提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为河南省新乡市农业科学院培育的‘新蜜一号’西瓜品种，材料分别于2016年和2017年2月初催芽播种，4月初定植于温室，于盛花期取新鲜花蕾进行花药培养试验。

1.2 方法

1.2.1 花蕾选取及处理 试验方法参考朱迎春等[7]。在西瓜植株进入盛花期时，早晨8:00采集花蕾并放置于自封袋中，洒水保湿，4℃冰箱低温预处理2 d。预处理结束后，挑选健康的花蕾，在超净工作台上用75%酒精表面消毒30 s，接着用0.1%饱和次氯酸钠溶液消毒10 min，最后用无菌水冲洗3次，剥取西瓜花药接种于诱导培养基上。

1.2.2 花蕾形态分级 采集和筛选不同形态的花蕾并进行分级（表1），接种在诱导培养基MS+1.0 mg·L-16-BA+3%蔗糖+0.5%琼脂上，pH=5.8。33℃高温条件下暗培养3 d，然后再置于25℃条件下暗培养至14 d，最后放置在光照条件下培养。每个形态的花蕾接种4皿，每皿接种10～15枚花药，3次重复。培养20 d后，观察不同形态花蕾产生的愈伤组织大小、颜色，并统计数目。

表1 不同形态的花蕾分级

1.2.3 不同热激处理时间 筛选处于单核中期至单核晚期的花药，接种在诱导培养基MS+1.0 mg·L-16-BA+3%蔗糖+0.5%琼脂上，pH=5.8。立即于33 ℃的高温条件下暗培养 1、3、5、7 d，然后再置于25℃条件下暗培养14 d，最后放置在光照条件下培养。每个处理接种4皿，每皿接种10～15枚花药，3次重复。20 d后观察愈伤组织生长情况，并记录其色泽、质地等特征。

1.2.4 不同激素诱导培养基 筛选处于单核中期至单核晚期的花药，接种在含有不同浓度6-BA和NAA的诱导培养基上（基本培养基为MS+3%蔗糖+0.5%琼脂）（表2），pH=5.8。33℃高温条件下暗培养3 d，然后再置于25℃条件下暗培养至14 d，最后放置在光照条件下培养。每个形态的花蕾接种4皿，每皿接种10～15枚花药，3次重复，以MS+3%蔗糖+0.5%琼脂（编号A0）为对照培养20 d后，观察产生的愈伤组织的大小、颜色并统计数目。

表2 6种不同激素配比的诱导培养基

1.3 统计与分析

用Microsoft Excel 2007统计试验数据，用浙江大学Data Process System V9.01进行试验数据分析。

2 结果与分析

2.1 花蕾形态对愈伤组织诱导率的影响

西瓜花药培养至20 d左右时，花药顶端中部陆续长出愈伤组织。愈伤组织的形态大致可以分为2种：一种是质地致密的黄绿色组织，一种是质地疏松的白色组织。选择质地致密的黄绿色愈伤组织进行分化培养，其增殖速度较快并有分化趋势。试验结果表明（表3），当花蕾和花药处于中等大小时，愈伤组织诱导率最高，花粉所处的发育时期为单核中晚期，为‘新蜜一号’花药接种的适宜时期。

表3 不同形态的花蕾的愈伤组织诱导率

2.2 热激处理时间对愈伤组织的影响

试验观察发现（表4），西瓜花药在33℃的高温条件处理3 d后再置于25℃条件下暗培养时，多数形成黄绿色愈伤组织，质地较密，愈伤组织生长优良。在33℃的高温条件下暗培养1 d和5 d后，形成黄白色愈伤组织或花药变黑。在33℃的高温条件下暗培养7 d，愈伤组织生长情况表现最差，全部发黑死亡。

表4 不同的热激处理时间对愈伤组织的影响

2.3 诱导培养基对愈伤组织诱导率的影响

试验结果表明（表5），‘新蜜一号’西瓜花药在6种激素诱导培养基上经过20 d左右的培养，愈伤组织诱导率差异显著。在6种激素处理中，A4、A5培养基即激素配比为1.0 mg·L-16-BA+0.4 mg·L-1NAA 和 1.5 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA 时，愈伤组织诱导率较高。A2、A6培养基愈伤组织诱导率次之，A0、A1、A3培养基愈伤组织诱导率最差。

表5 6种诱导培养基对愈伤组织诱导率的影响

3 讨论与结论

3.1 不同形态的花蕾

通过观察花蕾外部形态和花药颜色，建立花药发育阶段与花蕾外部形态的对应关系，从而确定花药取材的标准，为提高花药培养成活率提供了更为便捷的初期选材方法。西瓜花药培养的最佳时期是单核靠边期到双核期，以花药的色泽和花蕾的大小作为初步确定小孢子发育时期的标志[12]。就多数植物而言，单核中期至晚期的花粉最容易形成花粉胚或花粉愈伤组织，一般所处发育阶段越早的花粉，对培养条件的要求越苛刻，且培养效果不一定好[13]。与本试验的选材时期相符。但本试验仅从花蕾、花药的外观进行分析比较，而未从花蕾开放时期进行细分，后期将继续从花蕾选择方面进行深入研究，以便为初期提供更精准的花蕾材料。

3.2 热激处理时间对愈伤组织的影响

适宜的热激处理温度对愈伤组织或胚状体的形成以及促进其生长都有重要作用。李娟等[5]研究表明，36℃热激4 d时，西瓜小孢子的脱分化效果好。其中，‘271’小孢子脱分化率最高，为4.01%。西瓜花药需要在高温条件下处理，从而激发花药产生愈伤组织，时间过长或过短都会影响愈伤组织的生长质量。笔者发现，3 d为较理想的处理时长，但本试验设置的梯度以d为时间单位，下一步为获得更精确的热激处理时间，应加密时间梯度，以h为时间单位，进一步探索更精确的热激处理时间。

3.3 诱导培养基对愈伤诱导率的影响

不同激素对花药发育的影响是不同的，在西瓜花药培养中发现，6-BA在西瓜花药愈伤组织诱导中起着关键的作用，其质量浓度低于0.5 mg·L-1时，愈伤组织诱导率下降。NAA诱导愈伤组织的作用不强，但是愈伤组织的质量较好，有较高的分化潜力。缑艳霞[12]发现培养基为MS+1.5 mg·L-1KT+2.0 mg·L-16-BA+1.5 mg·L-1NAA 诱导‘拿比特’和‘喜都’西瓜花药愈伤组织频率最高且质量最好，外植体褐化率也较低。本试验仅对诱导愈伤组织进行试验和分析，但其分化和再生能力却不明确，还需进行后续的诱导分化。

现有的培养程序受基因型的影响仍然很大，不同基因型材料花药培养诱导成胚状体的频率差异十分显著。下一步应就花药培养进行更详实的跟踪和研究，及时发现各种影响因素的作用，并探索其作用机制，最后总结出西瓜花药培养各阶段的最适培养基。

[1]GÜRSÖZ N，ABAK K，PITRAT M，et al.Obtention of haploid plants induced by irradiated pollen in watermelon（Citrillus lanatusL.）[J].Cucurbit genetics Coop Rpt，1991，4：109-110.

[2]TAŞKıN H，YÜCEL NK，BAKTEMUR G，et al.Effects of different genotypes and gamma ray doses on haploidization with irradiated pollen technique in watermelon（Citrullus lanatusL.）[J].Can J Plant Sci，2013，93（6）：1165-1168.

[3]李玲，闵子扬，童龙，等.西瓜未授粉子房的离体培养[J].中国瓜菜，2014，27（6）：6-10.

[4]荣文娟，刘君璞，朱迎春，等.西瓜未受精胚珠离体培养若干影响因素的研究[J].中国瓜菜，2015，28（3）：9-13.

[5]李娟，张丽，李焕秀，等.西瓜花药培养技术研究[J].中国瓜菜，2008，21（4）：8-10.

[6]王开冻，魏跃.西瓜花药培养中不定芽的诱导与增殖[J].安徽农业科学，2008，36（16）：6826-6827.

[7]朱迎春，孙德玺，邓云，等.前期处理对西瓜花药培养愈伤组织诱导的影响[J].中国瓜菜，2012，25（5）：17-19.

[8]缑艳霞，张明方.西瓜花药离体培养影响因子研究[J].北方园艺，2013(10)：117-120.

[9]GAŁĄZKA J，NIEMIROWICZ-SZCZYTT K.Review of research on haploid production in cucumber and other cucurbits[J].Folia Hort，2013，25（1）：67-78.

[10]DONG Y Q，ZHAO W X，LI X H，et al.Androgenesis，gynogene⁃sis，and parthenogenesis haploidsin cucurbit species[J].Plant Cell Reports，2016，35（10）：1991-2019.

[11]魏跃，龚义勤，邓波，等.西瓜花药愈伤组织的诱导[J].湖北农业科学，2005（5）：93-95.

[12]缑艳霞.西瓜花药离体培养技术研究[D].杭州：浙江大学，2006.

[13]OZZAMBAK E，ATASSYAR A，COCKSHULL K E.Anther culture of tomoato and eggplants[J].Acta Horticulture，1994，366：229-233.

A study of factors affecting anther culture of watermelon

WANG Wenying,LIU Xicun,MA Xiaohong,GUO Chunjiang，DONG Yanqi
(Xinxiang Academy of Agricultural Sciences,Xinxiang 453000,Henan,China,)

The purpose of this experiment was to explore the bud morphological index,high temperature pretreatment and medium hormone formula of watermelon anther culture.The growth of callus was observed and analyzed through bud grading,high temperature pretreatment and different induction medium.The results showed that when the flower buds and anthers were in medium size,it was the suitable period for anther inoculation of the experimental materials.The anther of watermelon was treated of 3 days at 33℃，and then 14 days at 25℃,then the anther callus could be stimulated.The induction rate of callus was higher when the hormone ratio of induction medium was 1.0 mg·L-16-BA+0.4 mg·L-1NAA and 1.5 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA.

Watermelon;Anther culture;Bud morphological;High temperature pretreatment;Induction medium

2017-11-10；

2017-11-14

新乡市科技攻关计划项目（CXGG16002）

王文英，女，助理研究员，主要从事西甜瓜育种研究。Tel：0373-3670709；E-mail:wangwenying612@163.com