试述食品中大肠菌群检测与技巧

林永洁

摘 要：大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一。检测结果其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏染色阴性无芽孢杆菌。本文阐述了两个标准版本的大肠菌群检测中的检测步骤、方法对比及染色镜检技巧。

关键词：大肠菌群 检测 技巧

大肠菌群的测定，在实际工作中存在不同检测方法。GB/T4289.3-2003、GB4789.3-

2016版都是现行有效的两个版本的检验标准。尽管方法各异，但乳糖发酵却是这些不同方法中的共同点。

一、大肠菌群检测

1、培养基准备：培养基 GB/T4789.03—2003：乳糖胆盐发酵培养基，伊红美兰琼脂，乳糖复发酵培养基。GB 4789.03—2016：月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST），煌绿胆盐肉汤（BGLB）。仪器超净工作台、生化培养箱、显微镜。

2、实验原理和方法

2.1检验步骤

依据GB/T4789.3—2003（食品卫生微生物学检验大肠菌群测定，检验主要有以下步骤：

（1）接种：以无菌操作取均匀后检样25 mL（g）放于含有 225 mL灭菌生理盐水的灭菌三角烧瓶中，经充分振摇做成1：l0的均匀稀释样液。根据食品卫生标准要求和对样品污染情况的判断，选择3个稀释度，每个稀释度接种3管，放置36℃±l℃的生化培养箱内培养24±2h。

（2）平板分离：将产气的发酵管分别划线在伊红美蓝琼脂平板上，置36℃±l℃的生化培养箱内培养24±2h。

（3）染色和证实：观察菌落形态，并做革兰氏染色镜检。革兰氏染色阴性的无芽胞杆菌的试管接种乳糖发酵管，置于36℃±1℃的生化培养箱内培养24±2h。

（4）结果报告：凡是乳糖管产气、革兰氏染色阴性的无芽胞杆菌，判定该管为大肠菌群阳性。根据大肠菌群阳性的管数，查 MPN检索表，乘以稀释倍数，报告每100 mL（g）样品中大肠菌群的MPN值。

2.2测试步骤

依据GB 4789.3—2016 （食品安全国家标准微生物学检验大肠菌群测定》，测试主要有以下步骤：（1）接种：以无菌操作取均匀后检样25 mL（g）放入盛有225mL灭菌磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯中，经充分振摇做成1：10的均匀稀释样液。根据食品卫生标准要求和对样品污染情况的判断，根据污染情况判断，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液，选择3个稀释度，每个稀释度接种3管LST，放置 36±1℃的生化培养箱内培养24±2h。（2）证实：将产气的发酵管挑取一环菌液接种BGLB管，放置36±l℃的生化培养箱内培养48±2h。（3）结果报告：根据大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，乘以稀释倍数，报告每l mL（g）样品中大肠菌群的MPN值。在MPN检索表第一栏阳性管数下面列出的mL（g），系指原样品（包括液体和固体）的mL（g）数，并非样品稀释后的mL（g）数，对固体样品理应注意固体样品的接种量。

样品1 g经10倍稀释后，虽加入1 mL 量，但其实际其中只含有0.1 g样品，故应按0.1 g记，不应按 1 mL记。接种第一梯度1g×3的样量是10倍稀释液的10mL。

二、2003版与2016版的大肠菌群检测新方法对比

2003版大肠菌群检验步骤检验采用三步（即乳糖发酵试验、分离培养和证实试验）.在食品检验上，除个别情况外，一般来说，如果平板上有较多典型大肠菌群菌落，革兰氏染色为阴性杆菌，即可做出判定。如平板上典型菌落甚少或均不够典型，则应多挑菌落做证实试验，以免出现假阴性。只作一步初发酵，对某些食品来说，误差是比较大的。这样做，会有相当部分的合格样品被作为不合格样品处理，应予注意。

2016版大肠菌群检测新方法与国际接轨，检验新技术进入国标行列，它釆用了LST一BGLB进行发酵培养。接种LST肉汤初发酵培养，如产酸、产气将培养物转种于BGLB肉汤培养，根据其阳性管数查阅MPN检索表即可得到检测结果。2003版大肠菌群检测方法为经典方法，类似实验中仲裁法；2016版方法简便易行便于初学者（企业出厂检验人员）操作。类似实验中的快速测定，省时省力可提高速度与效率。在实际工作的检测中比对，两种方法并存结果不存在明显差异。

三、大肠菌群实验技巧

革兰氏染色镜检依据GB/T4789.3—2003标准。

典型菌落挑选→革兰氏染色镜检

3.1菌落挑选：在EMB平板上挑选典型菌落进行镜检

大肠杆菌菌落呈黑紫色有光泽或无光泽时，检出率最高；红色、粉红色菌落检出率较低。

挑取菌落数与大肠杆菌的检出率密切相关。

3.2革兰氏染色镜检

实际操作步骤技巧关键点在脱色。

（1）涂片：均匀而薄。

（2）固定：火焰固定时温度适宜，把涂片在酒精灯火焰上方、左右或以旋转方式快速通过，将涂片触碰手握拳头时虎口处，以不炽热为度，过热则镜检时菌体变形，不利于观察及判定。

（3）初染：滴加结晶染液1分钟完成，倾斜用细水流冲洗待干。

（4）媒染：滴加碘液媒染，水洗。

（5）脱色：掌握脱色度是染色成败的关键，G-菌细胞壁含有较多被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖质较薄，交联度低，用95%的乙醇脱色溶解了类脂质增加细胞通透性，使被染的结晶紫和碘复合物易于渗出，结果G-菌脱去初染的紫色，复染上蕃花花红的颜色，所以菌体呈红色。在实际操作中薄而均匀的涂片上滴加95%的乙醇约20至30秒，流出液体无色时终止脱色，否则脱色过度会造成G+误判为G-菌。

（6）沙黄复染液（番红花红）复染。

（7）冲洗：玻片倾斜，用稳定的细流冲洗。

（8）涂片宜挑取培养18～24h菌落，老龄化的G-菌呈G+菌，工作中注意避免出現假阳性和假阴性。

（9）镜检用10 ×100 油镜进行镜检，香柏油与载玻片的折射率相近，滴加香柏油会使通透性增加，在镜检中可观察到清晰的物象。在载玻片所要观察部位滴上一滴香柏油，换上油镜，小心调节粗准焦螺旋，使油镜慢慢下降或慢慢上升载合物台，从侧面观察油镜下端与标本之间的距离，当油镜下端开始触及油滴时即可停止。从目镜观察，用手调节粗准焦螺旋，即可观察到清晰的标本物像。

参考文献

[1]中华人民共和国国家标准GB 4789.3-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》.

[2]《食品微生物检测工作指南》中国标准出版社 2012年.