两种γ-干扰素释放试验方法对结核性胸膜炎诊断价值的探讨

漆 沄，谢 君，迟 旭，蔡华锋，李卫星 , 刘 媛,罗阿丽

1.西安市胸科医院内3科(西安 710100),2.西安市胸科医院检验科(西安 710100),3.西安市胸科医院病理科(西安 710100)

两种γ-干扰素释放试验方法对结核性胸膜炎诊断价值的探讨

漆 沄1，谢 君1，迟 旭1，蔡华锋1，李卫星1, 刘 媛2,罗阿丽3

1.西安市胸科医院内3科(西安 710100),2.西安市胸科医院检验科(西安 710100),3.西安市胸科医院病理科(西安 710100)

目的：探讨酶联免疫斑点试验(ELISPOT)和全血γ-干扰素释放试验(QFT-GIT)在结核性胸膜炎诊断中的临床价值。方法：对90例结核性胸膜炎患者与50例非结核性胸膜炎患者外周血分别用ELISPOT和QFT-GIT两种γ-干扰素释放试验进行检测，分析两种检测方法对结核性胸膜炎的准确性、敏感性、特异性、阳性预测值以及阴性预测值。结果：ELISPOT检测和QFT-GIT检测的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值比较均无统计学差异(P>0.05)，而ELISPOT检测的准确性明显大于QFT-GIT检测，比较有显著性差异(P<0.05)。结论：ELISPOT和QFT-GIT两种γ-干扰素释放试验用于结核性胸膜炎均有较好的诊断结果，但ELISPOT的准确性更高，且成本低。

全血γ-干扰素释放试验(QFT-GIT)和T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)是γ-干扰素释放试验(IGRA)中检验结核菌的发热两种较成熟方法，但国内对QFT-GIT与ELISPOT间的诊断结果研究很少，我院应用QFT-GIT和酶联免疫斑点试验(ELISPOT)分别检测结核性胸膜炎与非结核性胸膜炎患者血中γ-干扰素的表达，以评价这两种方法在结核性胸膜炎诊断中的临床价值。

资料与方法

1 一般资料 结核组患者选自我院2016年1月1日至2017年5月1日入我院治疗的结核性胸膜炎90例患者，排除其他因素造成的胸腔积液，经胸腔镜活检、胸膜针刺活检、胸膜组织病理学检查确诊为结核病变，且接受抗结核治疗<2周。其中男51例，女39例；平均年龄(39.9±7.1)岁。非结核组患者选自同期我院呼吸及肿瘤内科治的非结核性胸膜炎患者50例，经检查PPD结果为阴性，其中肿瘤性胸腔积液36例，肺炎旁积液10例，原发胸膜恶性病变4 例。肿瘤病理均经过病理细胞学证实，其他疾病经常规检验、影像学及疗效等证实；其中男28例，女22例；平均(42.1±11.6)岁；排除存在结核病及结核接触史患者。两组一般情怳无显著差异(P>0.05)，具有可比性。

2 方 法

2.1 ELISPOT检测：无菌方法下采集患者静脉血，室温下即刻离心，分离外周血单个核细胞，将分离出细胞重悬于细胞培养基AIM-V中并调整浓度为2.5×106个/ml的细胞悬液。操作严格按照T细胞ELISPOT诊断试剂盒(南通表源生物技术有限公司)说明书执行，即：每一细胞悬液样本取PVDF板3孔，每孔注入100 μl，阴性对照内加入无血清细胞培养液50 ml，阳性对照内加入植物血凝素(PHA)50 ml，检测孔加入ESAT-6/CFP-10特异性抗原融合蛋白50 ml,轻轻震荡、混匀，在37C 5%CO2培育箱中孵育16～20 h。进行孵育、清洗、加生物素标记抗体IFN-γ-biotion反应、避光显色等步骤，直至肉眼可见斑点形成后洗板以终止反应，于通风处自然晾干，孔内紫色斑点用肉眼或酶联斑点分析仪计数。结果判定：①阴性对照孔紫色斑点为0-5个，检测孔斑点数-阴性对照孔斑点数≥5个时，则结果为阳性；②阴性对照孔紫色斑点≥6个，检测孔斑点数≥2倍的阴性对照孔斑点数时，则结果为阳性。

2.2 QFT-GIT检测：采用QFT-GIT试剂盒(Cellestis公司)检测。QFT-GIT试剂盒提供阴性对照管(阴性管)、阳性对照管(阳性管)、结核抗原管(抗原管)3种采血管，操作步骤按说明书进行，即：静脉采血，在6 h内将肝素抗凝血加入以上3种管中，1 ml/管，振摇、混匀，竖直置于37C培养箱中培育24 h，离心后取上清液，用ELISA检测并用Multiskan GO酶标仪(Thermo Fisher Scientific公司)定量分析IFN-γ水平。结果判定：①阴性：当阳性管>0.5 IU/ml,抗原管-阴性管<0.35 IU/ml时，②阳性：当抗原管-阴性管≥0.35 IU/ml时；③不定：当阳性管<0.35 IU/ml, 抗原管-阴性管<0.35 IU/ml或阴性管≥8.0 IU/ml时。分析ELISPOT检测和QFT-GIT检测的准确性、敏感性、特异性、阳性预测值及阴性预测值。

结 果

ELISPOT检测和QFT-GIT检测的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值比较均无统计学差异(P>0.05)，而两组在准确性方面具有显著性差异(P<0.05)，提示结核性胸膜炎诊断辅以ELISPOT检测具有更高的临床价值，见表1。

表1 两组患者分别应用ELISPOT检测和QFT-GIT检测诊断结果比较

注：与ELISPOT组比，*P=0.019，∆P=0.681，▲P=0.134，☆P=0.188，eP=0.505.

讨 论

结核性胸膜炎是淋巴细胞介导的免疫疾病，感染者机体自身对结核菌有一定的抗性，有多种免疫细胞参与在机体免疫过程中，并能产生多种淋巴因子，如IL-2、γ-干扰素等[1]。γ-干扰素可促进前体T细胞分化为Th1细胞，提高Th1细胞的免疫应答能力分泌多种细胞因子，并能活化机体单核细胞使其集聚至病灶，以防止感染的发展、散播，促进肉芽肿的形成[2]。IGRA是近年来结核病诊断方面的一项重要突破，采用结核 菌抗原刺激PBMC产生效应T细胞或病变部位免疫细胞分泌γ-干扰素，以评判是否有结核菌感染。T-SPOT.TB采用结核菌复合群差异区基因RDI(Rv3871-Rv3879c)中编码的早期分泌的抗原靶(ESAT-6)和培养滤液蛋白(CFP-10)的多肽抗原，此外，QFT-GIT在以上基础上还加用了RD11区TB7.7(Rv2654)的部分多肽，这些多肽抗原仅存于结核菌复合群中，特异性极高，但其合成成本高，限制了其在发展中国家及结核病流行国家中的应用、推广[3]。ELISPOT应用的ESAT-6/CFP-10融合蛋白是通过基因工程合成而来，可大量生产，相对于多肽有明显的价格优势，且与T-SPOT.TB的检验结果一致[4]，有好的检验效果。

本文结果显示：两种检验方法的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值比较均无统计学差异，而两组在准确性方面具有显著性差异。此结果可能与两者的检测原理有关，ELISPOT检测的是经抗原刺激后可分泌γ-干扰素的效应T细胞，而QFT-GIT检测的是效应T细胞分泌的γ-干扰素水平，但致病菌诱导的机体免疫应答存在时效性，其产生的细胞因子也存在时效性，因此ELISPOT辅助诊断具有更好的优势。无法寻找到细菌学依据已成为结核菌感染诊断的难题，而杜凤娇[5]等报道指出，机体只要有结核菌感染，就可通过测定机体细胞免疫功能评判结核菌的感染情况，避免了结核菌素皮肤试验(TST)因PPD与卡介苗交叉蛋白而造成的假阳性检出。此外，本研究ELISPOT采用ESAT-6/CFP-10融合蛋白大大降低了临床诊断费用，使结核菌感染的ELISPOT检测在我国基层医院普及成为可能。但IGRA也存在一定的缺陷，不能区分患者结核病是近期还是有既往感染史、活动性还是潜伏性，当检出为阴性时不能排除感染，又或是结核菌受机体免疫限制，但依然有可能发展成活动性结核病，因而IGRA常作为辅助检测用于临床诊断。

综上，ELISPOT和QFT-GIT用于结核性胸膜炎均有较好的诊断结果，但ELISPOT的准确性更高，且成本低，更适合临床推广。

[1] 刘红艳，张 燕. 泻肺逐饮方治疗结核性胸膜炎疗效观察[J]. 陕西中医，2014,35(10)：1286-1287.

[2] 王 君，李季春，陈瑞琳，等.内科胸腔镜检查在结核性胸膜炎诊断中的应用价值[J]. 陕西医学杂志，2014,43(7)：858-859.

[3] 张 娟，印 璞，孙炳奇，等. 对比研究ELISPOT与QFT-GIT对于结核病诊断的应用价值[J]. 中国试验诊断学，2013,17(10)：1839-1842.

[4] 王晓伟，程筱雯，张 焰，等. 结核分枝杆菌CFP10、ESAT6蛋白的原核表达、纯化及ELISPOT检验方法的建立与应用[J]. 安徽医科大学学报，2015,50(9)：1347-1350.

[5] 杜凤娇，傅 瑜，吴雪琼，等. 结核分枝杆菌RD1区编码蛋白ELISPOT辅助诊断活动性结核病的应用价值[J]. 临床肺科杂志，2012,17(2)：264-266.

胸膜炎/诊断 @QFT-GIT @IGRA

R561.1

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.12.075

(收稿：2017-07-16)