微小RNA干扰抑制Aurora A表达对胶质瘤细胞化疗敏感性的影响*

侯鹏飞，李 楠，刘展会，程文佳△

1.西安市第九医院神经外科(西安 710054)，2.西安市儿童医院神经外科(西安 710043)

·基础研究·

微小RNA干扰抑制Aurora A表达对胶质瘤细胞化疗敏感性的影响*

侯鹏飞1，李 楠2，刘展会1，程文佳1△

1.西安市第九医院神经外科(西安 710054)，2.西安市儿童医院神经外科(西安 710043)

目的：探讨微小RNA干扰抑制Aurora A表达对胶质瘤细胞化疗敏感性的影响。方法：采用Aurora A特异性siRNA对人脑胶质瘤细胞进行转染，使用Western blot和RT-PCR对Aurora A mRNA及蛋白表达情况进行检测，同时使用化疗药物尼莫司汀(ACNU)对转染后人脑胶质瘤细胞进行处理，观察并分析处理前后胶质瘤细胞的增殖和凋亡情况。结果：40 mg/L ACNU处理后各组U251细胞吸光度较0 mg/L ACNU处理后各组细胞器吸光度值明显下降(P<0.05)，其中以siRNA干扰组细胞吸光度值最低(0.20±0.05)，细胞增殖抑制率为75.1%，远高于阴性对照组和正常对照组(P<0.05)；转染Aurora A siRNA的U251细胞在经40 mg/LACNU处理72h后，其细胞凋亡率明显高于0 mg/L处理组(P<0.05)，且siRNA干扰组的U251细胞在培养72 h后其凋亡率均明显高于正常对照组和阴性对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。结论：采用特异性微小RNA对Aurora A基因的表达进行干扰抑制，可有效阻碍胶质瘤细胞的增殖过程，且可有效提高胶质瘤细胞对于化疗药物的敏感性，有利于增强恶性胶质瘤术后化疗效果，对于改善患者生存质量，延长其生存时间具有十分积极的意义。

术后化疗在人脑胶质瘤治疗中发挥着十分关键的作用，对于降低肿瘤复发率具有十分重要的意义。尼莫司汀(Nimustine，ACNU)作为一种常用化疗药，由于具有较高的血脑屏障穿透性，目前被临床广泛采用为胶质瘤的主要化疗药物[1]。但调查指出，尽管ACNU可有效抑制残余胶质瘤组织的生长，但仍有部分患者的生存情况无法达到理想效果[2]。因此，探讨如何提高胶质瘤细胞的化疗敏感性对于提高此类患者生存质量具有十分重要的意义。Aurora A是一种新近发现的癌基因，在细胞有丝分裂过程中发挥着重要作用，同细胞异常扩增密切相关[3]。有报道指出，Aurora A的表达情况同肿瘤生物学行为之间存在密切相关性[4]。本研究以人脑胶质瘤细胞作为研究样本，采用微小RNA干扰技术对样本进行处理，以抑制Aurora A的表达，旨在探讨此种技术对胶质瘤细胞化疗敏感性的影响，现报告如下。

材料与方法

1 材 料 人脑胶质瘤U251细胞株由中国科学院上海细胞生物学研究细胞库提供，胰蛋白酶、新生牛血清、PRMI-1640培养基由Gibco公司生产；Opti-MEM培养基、Lipofectamine-2000、TRIzol试剂由Incitrogen公司生产；RT-PCR试剂盒由大连宝生物工程有限公司生产；PI凋亡检测试剂盒、FITC-Annexin V试剂盒由Sigma公司生产；Aurora A鼠抗人单克隆抗体、Wetern blot试剂盒由Santa Cruz公司生产；ACNU由日本三共株式会社生产。

2 研究方法

2.1 siRNA制备：设计并合成Aurora A特异性Oligo siRNA，并设置阴性对照组，所有样本均由上海康成生物公司提供。其中siRNA序列中以5’-GCCGGUUCAGAAUCAGAAGTT-3’作为正义链，以5’-CUUCUGAUUCUGAACCGGCTT-3’。阴性对照siRNA序列中以5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’作为正义链，以5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。RT-PCR引物设计方案如下：以5’-AATCTGGAGGCAAGGTTCGACTG-3’作为上游序列，以5’-TGGGAGATAAGTGGTTAAGGAGG-3’作为下游片段，以β-actin作为内参照，扩增片段设定为308bp。

2.2 胶质瘤细胞培养方法：取U251胶质瘤细胞，在10%新生牛血清RPMI-1640培养基中进行培养，恒温培养箱参数设定为：饱和湿度、5%CO2、37 ℃。待细胞接近生长成致密单层过80%长满后，进行传代，并将对数生长期细胞作为实验样本。

2.3 转染及分组：按照阳离子脂质体转染法，采用Lipofectamine-2000试剂进行相关操作，对Oligo siRNA进行荧光标记，对U251细胞进行转染，4 h后对转染效果进行观察，取20 nmol/L最佳转染浓度细胞进行实验，在CO2培养箱中进行培养，72 h后进行细胞收集。分别以Aurora A siRNA+脂质体+转染液作为siRNA干扰组，将阴性siRNA+脂质体+转染液作为阴性对照组，将脂质体+转染液作为正常对照组。取40 mg/L ACNU分别加入三组。

2.4 流式细胞术(FCM)检测：转染前24 h于6孔板中接种细胞，浓度为(1～2)×105个/孔，进行转染并取40 mg/L、0 mg/L ACNU进行培养，加液量控制为1.5 ml，72 h后进行细胞收集，常规离心、漂洗后取4倍稀释结合缓冲液100 μl使细胞悬浮，同时加入PI 100 μl和Annexin V FITC 5 μl，混合均匀后在避光室进行15～30 min孵育，再将其转移至5 ml流式反应管中，取PBS 400 μl加入后上机检测。

2.5 MMT检测：在100 μl无抗培养基中于转染前24 h在96孔板中进行接种，接种浓度设定为(0～1)×104个/孔，同时分别取0 mg/L、40 mg/L ACNU进行共同培养，培养72 h后将培养液吸出，取MMT液20 μl加入，于恒温培养箱中进行4 h孵育。之后将MTT液吸出，取DMSO 150 μl加入孔中，摇动混合10 min使结晶溶解。在560 nm处使用酶标仪对各孔吸光度值(A)进行读取，其中细胞生长抑制率(IR)定义如下：IR=(A对照组-A实验组)/A对照组×100%。

3 统计学方法 所有数据分析采用SPSS18.0统计学软件，计量资料以平均值±标准差表示，进行t检验，P<0.05认为差异具有统计学意义。

结 果

1 吸光度值 在采用Aurora A siRNA对U251细胞进行转染72 h后，40 mg/L ACNU处理后各组U251细胞吸光度较0 mg/L ACNU处理后各组细胞器吸光度值明显下降(P<0.05)，其中以siRNA干扰组细胞吸光度值最低，仅为0.20±0.05，细胞增殖抑制率为75.1%，远高于阴性对照组和正常对照组(P<0.05)。其中阴性对照组和正常对照组的细胞增殖抑制率并无明显统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 ACNU处理后各组细胞吸光度值

注：与siRNA干扰组相比，*P<0.05；与阴性对照组相比，△P>0.05

2 细胞凋亡 转染Aurora A siRNA的U251细胞在经40 mg/LACNU处理72 h后，其细胞凋亡率明显高于0 mg/L处理组，高达(21.29±1.81)%；且siRNA干扰组的U251细胞在培养72 h后其凋亡率均明显高于正常对照组和阴性对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)；正常对照组和阴性对照组的细胞凋亡率比较意义无统计学(P>0.05)。其中，siRNA干扰组细胞未经ACNU处理凋亡率同样明显高于阴性对照组和正常对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 Aurora A siRNA转染后经ACNU处理后U251细胞凋亡情况(%)

注：与siRNA干扰组相比，*P<0.05；与阴性对照组相比，△P> 0.05

讨 论

化疗是一种常用的恶性肿瘤治疗手段，主要通过对肿瘤细胞增殖进行抑制，并诱导其凋亡从而阻止恶性肿瘤的发生、发展[5]。对于脑胶质瘤患者而言，术后化疗可有效改善其临床症状，延长其生存时间。但既往研究证实，胶质瘤患者尽管接受术后化疗，但仍存在较高的复发率和死亡率。有研究认为，肿瘤细胞的耐药性和对化疗药物敏感性降低是造成胶质瘤患者术后复发率居高不下的主要原因[6]。因此，探讨如何提高胶质瘤细胞的化疗敏感性对于提高此类患者的生存质量具有十分重要的临床意义。

ACNU是一种细胞周期非特异性抗肿瘤药物，主要通过对肿瘤细胞有丝分裂进行抑制从而发挥抗肿瘤效果[7]。药理实验证实，ACNU具有较高的血脑屏障穿透性，在给药30 min后，脑脊液中血药浓度即可达到高峰[8]。尽管当前临床普遍在脑胶质瘤治疗中应用ACNU进行化疗，但大量报道据指出，在采用ACNU进行恶性胶质瘤化疗时，患者6个月无进展生存率仅为20%。Aurora A是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在细胞有丝分裂过程中具有十分关键的作用。Jeng等研究指出，Aurora A同恶性肿瘤之间存在一定相关性，特别是在膀胱癌、食管癌等恶性肿瘤中，Aurora A表达水平同患者的肿瘤生物学行为之间存在显著联系。Klein 等研究指出，脑胶质瘤中存在一定程度的Aurora A表达，认为其同胶质瘤的发生、发展密切相关。微小RNA干扰是近年来临床新兴的一种抗肿瘤技术，可对恶性肿瘤基因进行高效特异性抑制[9]。在本次研究中，首先合成Aurora A基因针对特异性Oligo SiRNA，病对胶质瘤U251细胞株进行转染，检测结果显示，转染后U251细胞中Aurora A基因表达显著降低，提示Aurora A基因的表达被Aurora A siRNA成功抑制。之后培养细胞样本，并采用ACNU对Aurora A siRNA转染后胶质瘤U251细胞进行处理，MTT检测显示，经Aurora A siRNA转染处理后，胶质瘤U251细胞在经ACNU处理后其细胞增值率较未经转染细胞明显升高，其中采用40 mg/L ACNU对转染Aurora A siRNA转染后U251胶质瘤细胞进行处理，其增值抑制率可达75.1%，显著高于阴性对照组、正常对照组。流式细胞术检测结果则显示，转染Aurora A siRNA的胶质瘤U251细胞在经过ACNU处理后，其细胞凋亡率明显上升(21.29%±1.81%)，同阴性对照组、正常对照组相比明显升高。其中经Aurora A siRNA转染后且未经ACNU处理的胶质瘤U251细胞器凋亡率同样明显高于正常对照组、阴性对照组，表明采用特异性微小RNA对Aurora A基因表达进行抑制，可有效对胶质瘤细胞增殖进行抑制，且有助于提高胶质瘤细胞的的化疗药物敏感性。

综上所述，采用特异性微小RNA对Aurora A基因的表达进行干扰抑制，可有效阻碍胶质瘤细胞的增殖过程，且可有效提高胶质瘤细胞对于化疗药物的敏感性，有利于增强恶性胶质瘤术后化疗效果，对于改善患者生存质量，延长其生存时间具有十分积极的意义。

[1] 刘细国,付 锴.RNA干扰沉默MSI1表达对人脑胶质瘤细胞化疗敏感度的影响[J].肿瘤防治研究,2016,43(9):754-757.

[2] 周章明.RNA干扰抑制EZH2基因表达对人胶质瘤细胞凋亡及对卡莫司汀敏感性的影响[J].山东医药,201 4,54(34):14-17.

[3] 陈浙涓,关方霞,刘英强.共济失调-毛细血管扩张症致病基因RNA干扰对恶性人脑胶质瘤细胞放射敏感性的影响[J].中华实验外科杂志,2013,30(6):1268-1270.

[4] Yunliang Xie,Yanbo Liu,Weigao Shen,etal.Survivin-specific small interfering RNAs enhance sensitivity of glioma U-87MG cells to paclitaxel by promoting apoptosis[J].中国神经再生研究:英文版,2012,7(13):1013-1019.

[5] 李东辉,刘清娥,王海鹏,等.重组人血管内皮抑素在老年恶性肿瘤胸腹腔积液治疗中的研究[J].陕西医学杂志,2015,44(9):1138-1139,1195.

[6] 韩 为,阴 彬,彭小忠.小RNA干扰PCBP2在神经胶质瘤细胞中对P53相关基因的调节和对细胞增殖的影响[J].基础医学与临床,2014,34(6):776-781.

[7] 陈 锋,黄 星,周 毅.小干扰RNA抑制人RUNT相关转录因子2、半乳糖凝集素-3的表达及其对胶质瘤U251细胞增殖和凋亡的影响[J].中华实验外科杂志,2013,30(9):1821-1824.

[8] Cuiyun Sun,Qian Wang,Hongxu Zhou,etal.Antisense MMP-9 RNA inhibits malignant glioma cell growth in vitro and in vivo[J].神经科学通报:英文版,2013,(1):83-93.

[9] 张晓炜,魏 琳.扶正汤结合化疗对恶性肿瘤患者生活质量及无进展生存期的影响[J].陕西中医,2015,36(10):1383-1384.

EffectofmicroRNAinterferenceonthesensitivityofAuroraAexpressiontochemosensitivityofgliomacells

Hou Pengfei, Li Nan, Liu Zhanhui, et al.

Department of Neurosurgery, Xi'an Ninth Hospital(Xi'an 710054)

Objective: To investigate the effect of microRNA interference on the sensitivity of Aurora A to glioma cell chemosensitivity. Methods: Aurora A-specific siRNA was used to transfect human glioma cells. Western blot and RT-PCR were used to detect the expression of Aurora A mRNA and protein. At the same time, the chemotherapy drug Nimustine (ACNU) .The glioma cells were treated and the proliferation and apoptosis of glioma cells were observed before and after treatment. Results: The absorbance of U251 cells in each group treated with 40mg / L ACNU was significantly lower than that of 0mg / L ACNU (P<0.05). The cell absorbance was the lowest (0.20 ± 0.05) (P<0.05). The apoptosis rate of U251 cells transfected with Aurora A siRNA was significantly higher than that of the control group (P<0.05), and the apoptosis rate of U251 cells treated with 40mg / LACNU was significantly higher than that of the control group (P<0.05), and the apoptotic rate of U251 cells in siRNA-treated group was significantly higher than that in normal control group and negative control group (P<0.05). Conclusion: The specific microRNA can inhibit the expression of Aurora A gene and can effectively inhibit the proliferation of glioma cells, and can effectively improve the sensitivity of glioma cells to chemotherapeutic drugs, which is helpful to enhance the expression of malignant gliomas Postoperative chemotherapy effect, for improving the quality of life of patients, to extend their survival time has a very positive significance.

Glioma/Immunology RNA interference @Chemosensitivity Oncogenes/Immunology Cell proliferation Apoptosis Nimustine

*陕西省卫生和计划生育委员会科研项目(2013JM40172)

△通讯作者

神经胶质瘤/免疫学 RNA干扰 @化疗敏感性 癌基因/免疫学 细胞增殖 细胞凋亡 尼莫司汀

R739.4

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.12.001

(收稿：2017-03-21)