链格孢侵染对厚皮甜瓜抗菌物质及活性氧代谢相关酶活性的影响

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(新疆农业大学食品科学与药学学院,新疆乌鲁木齐 830052)

链格孢侵染对厚皮甜瓜抗菌物质及活性氧代谢相关酶活性的影响

李梦,白羽嘉,王玉红,张明明,玛尔哈巴·帕尔哈提,张露云，冯作山*

(新疆农业大学食品科学与药学学院,新疆乌鲁木齐 830052)

以伽师瓜为材料,研究贮藏期间果皮与果肉对病原菌抵抗能力的差异。分别采用3 mm(果皮)、5 mm(果皮果肉交界)、10 mm(果肉)深度接种链格孢(Alternariaalternata)后,于7 ℃贮藏。定期检测果皮与果肉病斑直径、总酚和黄酮含量及多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性。结果表明:贮藏期间,不同接种深度的果皮病斑直径显著小于果肉(p<0.05),果皮的抗病能力大于果肉;3、5、10 mm接种组果皮与果肉的抗菌物质含量和活性氧代谢相关酶活性显著高于对照(p<0.05),其中3 mm接种组果实具有较高的抗性;甜瓜果皮与果肉协同抵御链格孢的侵染,果皮发挥更大的抗病作用。

厚皮甜瓜,链格孢,抗菌物质,活性氧代谢相关酶

厚皮甜瓜(CucumismeloL.)属葫芦科(Cucurbitaceae)黄瓜属(CucumicLinn.)植物[1]。由于甜瓜采收期正值夏季高温,采后极易遭受病原菌侵染[2]。链格孢菌(Alternariaalternata)引起的黑斑病是甜瓜储藏期间危害性最大的病害[3-4]。伽师瓜属晚熟厚皮甜瓜,是新疆最耐储运的甜瓜品种[5-6]。

果皮是果实抵御病原菌侵染的第一道防线[7],甜瓜果皮与果肉在结构、组织上有很大的区别。甜瓜果皮组织致密,富含果胶、纤维素和木质素等物质;果肉细脆或松软,富含糖类、蛋白质、VC等营养物质。研究发现链格孢侵染甜瓜0～13 d,果实未出现明显病斑,但在侵染中后期,病斑迅速扩大[8]。推测侵染前期果皮有效阻止了病原菌的侵染;中后期,病原菌突破果皮的防线,果肉抵御能力较弱,病原菌在果肉中迅速繁殖,病斑直径迅速扩大。

本研究为探索甜瓜果皮与果肉抵御病原菌侵染能力的差异,甜瓜果实不同深度接种链格孢,测量贮藏期间果皮与果肉病斑大小,分析抗菌物质含量及活性氧代谢相关酶活性的变化规律,比较果皮与果肉抵抗病原菌侵染能力的差异,了解甜瓜抗病性反应,为甜瓜采后病害的控制研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

晚熟厚皮甜瓜品种“伽师瓜”,选取可溶性固形物≥14%,单果重3.5±0.5 kg,无病虫害、无机械损伤的果实,于2016年7月采摘于新疆喀什地区伽师县。链格孢(Alternariaalternata)由新疆农业大学食品科学与药学学院微生物实验室提供,分离自伽师瓜自然发病的果实,PDA保存待用。冰醋酸、无水醋酸钠、聚乙二醇6000、聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、邻苯二酚、Triton X-100、愈创木酚、30% H2O2、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、二硫苏糖醇(DTT)、甲硫氨酸、氮蓝四唑(NBT)、EDTA-Na2、核黄素等 均为分析纯(AR),购自天津市光复精细化工研究所。

FA2104N型电子天平 上海民桥精密科学仪器有限公司;NBCJ-B型无菌操作台、MHP-250型恒温培养箱 上海鸿都电子科技有限公司;LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂;TGL-16G型高速冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂;TU-1810型紫外-可见分光光度计 北京普析通用公司;FE20型pH计 梅特勒-托利多仪器有限公司;XSP-2C型显微镜 上海蔡康光学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 甜瓜链格孢侵染 链格孢接种PDA培养基,28 ℃培养7 d,收集孢子。用含有0.01% Tween-80的无菌水配制浓度为1×106个/mL孢子悬浮液。甜瓜用2%过氧化氢消毒,清水洗净后晾干,7 ℃预冷。在甜瓜果实赤道等距刺孔6个(直径3.5 mm),深度分别为3、5及10 mm,接种20 μL的孢子悬浮液,其中3 mm深度接种到甜瓜果皮组织,5 mm深度接种到甜瓜果皮与果肉交界处,10 mm深度接种到甜瓜果肉组织,对照组为3种深度接入等量的无菌水。接种后,置于7 ℃、相对湿度85%～90%的冷库贮藏。分别于处理后每隔4 d取甜瓜病斑周围5 mm处的组织,液氮速冻,-80 ℃保存。

1.2.2 病斑直径的测量 在接种链格孢部位将甜瓜果实纵向剖开,测定果实过敏反应组织,每次测定6个瓜,计算平均值,即为病斑直径。

1.2.3 黄酮含量的测定 采用NaNO2-Al(NO3)3比色法[9]。

1.2.4 总酚含量的测定 采用Folin-Ciocalteu比色法[10]。

1.2.5 多酚氧化酶(PPO)活性的测定 参照曹健康[11]方法,以每克鲜重果蔬样品每分钟吸光度变化值增加1时为1个活性单位(U),计算公式为:

1.2.6 过氧化物酶(POD)活性的测定 参照曹健康[11]方法,以每克鲜重样品每分钟吸光度变化值增加1时为1个活性单位(U),计算公式为:

1.2.7 超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定 参照曹健康[11]方法,以每分钟每克鲜重组织的反应体系对氮蓝四唑(NBT)光化还原的抑制为50%时为一个SOD活性单位(U),计算公式为:

1.2.8 过氧化氢酶(CAT)活性的测定 参照Ren等[12]方法,以每克鲜重组织每分钟OD值变化0.01为1 U,用U·g-1FW表示。

1.3 数据分析与作图

采用SPSS 19.0软件进行数据分析,利用Origin 8.5软件绘图。

2 结果与分析

2.1 链格孢侵染甜瓜病斑直径的变化

甜瓜接种链格孢后,每4 d测定甜瓜病斑大小(图1)。链格孢侵染甜瓜第12 d时,果皮与果肉出现病斑直径,并随贮藏时间延长均呈不断增大的趋势,果肉的病斑直径大于果皮,差异显著(p<0.05)。侵染第40 d时,3、5、10 mm接种果皮的病斑直径分别是对应果肉的1.15、1.18、1.25倍;侵染期间,10 mm接种果皮与果肉病斑直径大于3 mm和5 mm接种处理(p<0.05);3 mm接种果皮与果肉病斑直径较小,且3 mm接种果皮病斑直径最小。结果表明:果皮对链格孢侵染的抵抗能力大于果肉,果皮是抵御链格孢侵染的第一道防线。

图1 链格孢侵染甜瓜病斑直径的变化Fig.1 Change of A.alternata infection on lesion diameterin of muskmelon

2.2 链格孢侵染对甜瓜抗菌物质含量的影响

2.2.1 链格孢侵染对甜瓜黄酮含量的影响 甜瓜接种链格孢,在贮藏期间果皮与果肉黄酮含量随贮藏时间的延长均呈先升高后下降的变化趋势,且3种接种组的黄酮含量均高于相对应的对照组,差异显著(p<0.05)。甜瓜接种链格孢第24 d时,3 mm接种果皮与果肉的黄酮含量大于5 mm和10 mm接种处理(p<0.05);3种不同深度接种果皮和果肉的黄酮含量均达到峰值,其中3 mm接种果皮的黄酮含量比10 mm高33.80%(p<0.01)(图2A);3 mm接种果肉的黄酮含量比10 mm 高28.16%(p<0.01)(图2B)。在贮藏期间,3种接种组的果皮黄酮含量均高于同时段的果肉,差异极显著(p<0.01)。

图2 链格孢侵染对甜瓜果皮(A)与果肉(B)黄酮含量的影响Fig.2 Effects of A. alternata infection on flavonoids content in pericarp(A)and sarcocarp(B)of muskmelon

2.2.2 链格孢侵染对甜瓜总酚含量的影响 甜瓜接种链格孢,在贮藏期间果皮与果肉总酚含量随贮藏时间延长均呈先升高后下降的变化趋势,且3种接种组的总酚含量均高于相对应的对照组,差异显著(p<0.05)。甜瓜接种链格孢第28 d,3种深度接种果皮的总酚含量达到峰值,3 mm接种果皮的总酚含量大于5 mm和10 mm接种处理,3 mm接种高于10 mm 11.63%(p<0.05)(图3A);甜瓜接种链格孢第24 d,3种深度接种果肉的总酚含量达到峰值,各处理间总酚含量差异不显著(p>0.05)(图3B)。在贮藏期间,3种接种组果皮的总酚含量均高于同时段的果肉,差异极显著(p<0.01)。

图3 链格孢侵染对甜瓜果皮(A)与果肉(B)总酚含量的影响Fig.3 Effects of A. alternata infection on total phenolic content in pericarp(A)and sarcocarp(B)of muskmelon

2.3 链格孢侵染对甜瓜活性氧代谢相关酶活性的影响

2.3.1 链格孢侵染对甜瓜PPO活性的影响 甜瓜接种链格孢,在贮藏期间果皮与果肉PPO活性随贮藏时间延长均呈先升高后下降的变化趋势,且3种接种组的PPO活性均高于对照组,差异显著(p<0.05)。甜瓜接种链格孢,3种深度接种果皮的PPO活性先升高达到峰值后急剧下降最终趋于平缓。第12 d,5 mm接种果皮的PPO活性达到峰值;第16 d,3 mm和10 mm接种果皮活性达到峰值,3 mm接种果皮活性高于10 mm 11.11%(p<0.05)(图4A);甜瓜接种链格孢第12 d,3 mm和5 mm接种果肉的PPO活性达到峰值;第16 d,10 mm接种果肉活性达到峰值,3 mm接种果肉活性高于5 mm 21.43%(p<0.05)(图4B)。3种接种组果皮的PPO活性峰值均高于果肉,差异显著(p<0.05)。

图4 链格孢侵染对甜瓜果皮(A)与果肉(B)PPO活性的影响Fig.4 Effects of A. alternata infection on PPO activity in pericarp(A)and sarcocarp(B)of muskmelon

2.3.2 链格孢侵染对甜瓜POD活性的影响 甜瓜接种链格孢,在贮藏期间果皮与果肉POD活性随贮藏时间延长均呈先波动升高后下降的变化趋势,且3种接种组的POD活性均高于对照组,差异显著(p<0.05)。甜瓜接种链格孢第28 d,10 mm接种果皮的POD活性达到峰值;第32 d,3 mm和5 mm接种果皮活性达到峰值,3 mm接种果皮活性高于10 mm 22.17%(p<0.05)(图5A);甜瓜接种链格孢第24 d,3种接种果肉的POD活性均达到峰值,3 mm接种果肉活性高于10 mm 14.63%(p<0.05)(图5B)。贮藏期间,3种接种组果皮的POD活性均高于果肉,差异极显著(p<0.01)。

图5 链格孢侵染对甜瓜果皮(A)与果肉(B)POD活性的影响Fig.5 Effects of A.alternata infection on POD activity in pericarp(A)and sarcocarp(B)of muskmelon

2.3.3 链格孢侵染对甜瓜SOD活性的影响 甜瓜接种链格孢,在贮藏期间果皮与果肉SOD活性随贮藏时间延长均呈先升高后下降的变化趋势,且3种深度接种果实的SOD活性均高于对照组,差异显著(p<0.05)。甜瓜接种链格孢第28 d,3种深度接种果皮的SOD活性均达到峰值,其中3 mm接种活性高于10 mm 22.10%(p<0.05)(图6A);甜瓜接种链格孢,果肉的SOD活性在接种中后期变化平缓。第32 d,3种深度接种果肉的SOD活性达到峰值,3 mm接种果肉活性最大(图6B)。贮藏期间,3种接种组果皮的SOD活性均高于果肉,差异极显著(p<0.01)。

图6 链格孢侵染对甜瓜果皮(A)与果肉(B)SOD活性的影响Fig.6 Effects of A.alternata infection on SOD activity in pericarp(A)and sarcocarp(B)of muskmelon

2.3.4 链格孢侵染对甜瓜CAT活性的影响 甜瓜接种链格孢,在贮藏期间果皮与果肉的CAT活性随贮藏时间延长均呈先升高后下降的变化趋势,且3种接种组的CAT活性均高于对照组,差异显著(p<0.05)。甜瓜接种链格孢第28 d,10 mm接种果皮的CAT活性达到峰值;第32 d,3 mm和5 mm接种果皮的CAT活性达到峰值,3 mm接种活性高于5 mm 14.15%(p<0.05)(图7A);甜瓜接种链格孢第16 d,3种接种果肉的CAT活性达到峰值,3 mm接种果肉活性高于10 mm 16.29%(p<0.05)(图7B)。3种接种组果皮的CAT活性峰值均高于果肉,差异显著(p<0.05)。

图7 链格孢侵染对甜瓜果皮(A)与果肉(B)CAT活性的影响Fig.7 Effects of A.alternata infection on CAT activity in pericarp(A)and sarcocarp(B)of muskmelon

3 讨论

植物在抗病过程中,常伴有生理生化的变化[13-14],如小分子抗菌物质黄酮、总酚和活性氧代谢相关酶PPO、POD、SOD、CAT等的变化[15]。类黄酮可以抑制真菌孢子的萌发和生长[16],同时是重要的植保素,抑制病斑扩大及病原物在未侵染细胞中的扩增,其产生速度和积累的量直接反映植物抗病性的强弱[17]。

酚类是植物重要的抗菌性物质,在PPO作用下氧化成对病原菌高毒性的醌类物质,直接抑制侵染寄主的病原物生长[18-20]。同时,酚类物质还参与果皮中木质素的形成;且与纤维素共同作用增强果实的果皮结构,从而提高其抗病性[21-22]。

活性氧(ROS)是细胞信号传导和调控的重要组成部分[23-25]。植物被病原菌侵染后会产生活性氧爆发,直接杀死病原微生物,促进细胞壁木质化等[26],增强抗病性。但高浓度活性氧也会对自身产生伤害,因而植物体内普遍存在着活性氧清除酶。SOD、PPO、POD和CAT就是清除活性氧的主要酶[27-30],控制活性氧的合成、积累和消除,维持活性氧代谢平衡。而抗氧化酶活性的升降表明植物尽其所能地抑制病原物的侵入和繁殖,又可使活性氧对其自身的危害降至最低[31]。

本研究中,对甜瓜进行3、5、10 mm穿刺深度接种链格孢处理,3种深度接种处理组的果皮与果肉均在链格孢侵染第12 d出现病斑,12～40 d病斑直径不断扩大,果肉的病斑直径大于果皮;其中3 mm接种果实的病斑直径最小,10 mm最大,5 mm介于中间。3种接种组的甜瓜在链格孢侵染期间,果皮与果肉的总酚、黄酮含量及PPO、POD、SOD、CAT活性均呈现先升高后下降的变化趋势,并显著高于对照组,说明总酚、黄酮及活性氧代谢相关酶在链格孢侵染甜瓜后积极地发挥抗性作用。3 mm接种果实的抗菌物质含量与活性氧代谢相关酶活性在链格孢侵染期间均整体大于5 mm和10 mm接种组,10 mm接种组的抗菌物质含量与酶活性较小,这与3 mm接种果实的病斑直径最小一致。说明链格孢侵染甜瓜期间,果皮发挥了关键抵御作用,果肉协同果皮积极地抵御链格孢的侵染。

4 结论

对甜瓜采用3、5、10 mm不同深度接种链格孢处理后,3 mm接种果实的病斑直径最小,果肉的病斑直径显著大于果皮。甜瓜果皮与果肉通过增高抗菌物质黄酮与总酚含量及活性氧代谢相关酶活性来抵御链格孢的侵染,果皮的抗菌物质含量与活性氧代谢相关酶活性显著高于果肉。果皮和果肉均发挥抵御病原菌的作用,但是果皮发挥更大的作用。

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EffectsofAlternariaalternatainfectiononantimicrobialsubstancesandactivitiesofenzymesrelatedtoreactiveoxygenmetabolisminMuskmelon

LIMeng,BAIYu-jia,WANGYu-hong,ZHANGMing-ming,MaerhabaPaerhati,ZHANGLu-yun,FENGZuo-shan*

(College of Food Science and Pharmacy,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,china)

Take Jiashi Melon as the experimental materials,this study was aimed to study the resistance difference of pericarp and sarcocarp to pathogenic bacteria during storage.muskmelon was inoculated withA.alternataat different depths were 3 mm(pericarp),5 mm(pericarp and sarcocarp at the junction)and 10 mm(sarcocarp),and stored at 7 ℃ cold storage.Regular inspection of the Lesion diameter of pericarp and sarcocarp,the contents of total phenols and flavonoids in antibacterial substances,and the activities of polyphenol oxidase(PPO),peroxidase(POD),superoxide dismutase(SOD)and catalase(CAT)activity. The results revealed that pericarp lesion diameter was significantly smaller than the sarcocarp(p<0.05)during the storage. The disease resistance of pericarp is greater than sarcocarp. The contents of antibacterial substances and reactive oxygen metabolism related enzymes in the 3,5 and 10 mm inoculated groups were significantly higher than those in the control group(p<0.05),the fruit of 3 mm inoculation group had higher resistance to disease,pericarp and sarcocarp cooperate to resist the infection ofAlternariaalternata,pericarp exerts a greater resistance to disease.

muskmelon;Alternariaalternata;antibacterial substances;activity of enzymes related to reactive oxygen metabolism

2017-06-20

李梦(1993-)，女，硕士研究生，研究方向：食品加工原理与技术，E-mail：limeng19920824@126.com。

*通讯作者:冯作山(1963-)，男，博士，教授，研究方向：农产品贮藏与加工，E-mail：fengzuoshan@126.com。

国家自然科学基金项目(31460413)。

TS255.1

A

1002-0306(2017)23-0245-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.23.045