天然植物粗提物对蓝莓贮运病菌的抑制效果

,,,,,*

(1.湖南大学研究生院隆平分院,湖南长沙 410125;2.湖南省农业科学院农产品加工研究所,湖南长沙 410125)

天然植物粗提物对蓝莓贮运病菌的抑制效果

王伟1,阳秀莲1,袁洪艳2,林树花2,张菊华2,*

(1.湖南大学研究生院隆平分院,湖南长沙 410125;2.湖南省农业科学院农产品加工研究所,湖南长沙 410125)

为了筛选出对蓝莓鲜果贮运有较好应用保鲜效果的天然保鲜剂,采用牛津杯法开展21种植物粗提物对蓝莓贮藏中分离的3种病原真菌和物流中常见2种食源性致病细菌的抑菌活性的研究,并确定其最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC),研究提取液浓度变化对病原菌抑制率的影响和进行提取液复配抑菌实验。结果表明:丁香提取物对真菌的抑制能力表现最强,对灰霉、链格孢霉和青霉的平均抑菌圈直径分别为47.58、39.68和40.54 mm,对这3种真菌的MIC分别为15.63、31.25、31.25 mg/mL,MBC分别为31.25、62.5 和62.5 mg/mL;五味子提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效果最强,对这2种细菌的平均抑菌圈直径分别为42.08、28.49 mm,MIC分别为31.25、62.5 mg/mL,MBC分别为62.5、125 mg/mL。丁香和五味子提取液浓度梯度的变化对不同病原菌抑制率的影响存在差异,高浓度变化影响较大,丁香和五味子复配液比例大于5∶5可作为较佳的蓝莓贮运保鲜复配应用参考。

蓝莓,贮运病菌,植物粗提物,抑菌效果,复配

蓝莓又名越橘(Vacciniumspp.),蓝莓属于呼吸跃变型果实,含水率高、果皮薄,成熟在高温多水的夏季且采摘期比较集中,采后极不耐贮藏,常温下放置2～4 d 就开始腐烂变质,鲜果特别容易受机械损伤和微生物侵染而导致腐烂发霉,影响采后的贮藏、运输及销售。

随着食源性疾病的不断上升,农产品微生物污染引起的疾病风险也逐渐受到世界各国的关注,细菌性微生物更是导致我国食源性疾病发生的主要病因,蓝莓等浆果类农产品由于易腐易烂的特性,长期暴露在冷链保护之外,容易滋生细菌,不慎食用将危害身体健康,而当前我国的果蔬冷链物流基础设施仍不完善,相关标准未与国际接轨,冷链流通环节十分薄弱,严重存在食源性致病细菌的滋生风险[1-4]。

近年来,人们对食品安全越来越关注,探索安全、高效、环保、经济的绿色新型果蔬贮运保鲜技术已成为当下研究的热点。天然植物提取物中含有抑制病原微生物、抗菌、抗炎、抗癌等生物活性成分[5-7],对果蔬有防腐保鲜作用且无毒、无害、无残留,食用安全,能有效延长果蔬货架期寿命,其中从中草药和香辛料中提取天然活性成分被认为是食品防腐保鲜研究领域最具前景的发展方向,是开发新型高效果蔬生物防腐保鲜剂的重要途径[8]。在天然植物源保鲜剂的应用研究中,对草莓[9]、柑橘[10]、猕猴桃[11]等都起到了良好的贮藏保鲜效果,大大地延长了货架期,而天然植物源保鲜剂对蓝莓贮藏保鲜的研究却鲜有报道。

本研究以天然植物粗提物为抑菌剂,通过研究对采后自然贮藏腐烂的蓝莓果实中分离出的3种主要病原霉菌和物流中常见2种食源性致病细菌的体外抑菌能力,筛选出对蓝莓贮运保鲜和食用安全有潜在应用效果的植物提取物,为蓝莓鲜果绿色保鲜技术及高效、广谱、无毒、天然植物源新型绿色防腐保鲜剂的研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

迷迭香、青花椒、绿茶、丁香、牛至、金银花、黄芩、八角、五味子、连翘、肉桂、高良姜、艾蒿、马尾松、厚朴、百里香、薄荷、荷叶、黑胡椒、白鲜、广藿香 购自湖南省长沙市高桥市场;从采后贮藏的湖南省长沙县兔眼蓝莓(粉蓝)果实上分离出3种主要病原真菌,分别为灰霉(Botrytiscinerea)、链格孢霉(Alternariaalternata)和青霉(Penicilliumsp.);金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和大肠杆菌(Escherichiacoli) 由中国普通微生物菌种保藏管理中心提供,所有菌株3 ℃冰箱保存,备用;营养琼脂培养基(NA)、马铃薯葡萄糖琼脂(PDA) 购自广东环凯微生物科技有限公司;MH肉汤(MH Broth)、马铃薯液体培养基(含氯霉素) 青岛高科技工业园海博生物技术有限公司;无水乙醇 国药集团化学试剂有限公司;无菌生理盐水 按照无菌检查法配制。

SW-CJ-1B型超净工作台 苏州净化设备有限公司;HWS型智能恒温恒湿培养箱 宁波江南仪器厂制造;LX-B100 L型立式自动电热压力蒸汽灭菌器 合肥华泰医疗设备有限公司;SHA-B型水浴恒温振荡器 金坛市医疗仪器厂;GL-888旋涡混合器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司;750T西厨多功能粉碎机 铂欧五金厂;RE-52AA旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;循环真空泵 郑州长城科工贸有限公司;回流冷凝装置 北京德天佑科技有限公司;AP-01P真空抽滤泵 天津奥特赛恩斯仪器有限公司;KQ-700DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 提取液制备 参考寥珏[12]的制备方法略作改进,将植物原料干燥粉碎,过40目筛,称取500 g干粉装入广口三角瓶中,加入70%乙醇,料液比为1∶5,浸泡24 h;经40 MHz超声辅助提取2 h后真空抽滤,收集滤液,再次加入70%乙醇,重复上述过程3次,合并滤液,旋转蒸发(40 ℃,100 r/min)浓缩得植物提取物浸膏,装入250 mL蓝盖棕色玻璃试剂瓶,前后称重。

按以下公式计算提取率:

P(%)=m/W×100

式中,P-植物粗提物提取率(%);m-植物浸膏实际提取重量(g);W-植物干粉原料重量(g)。

根据提取率计算结果称取一定量提取物浸膏均先用0.6 mL 50%乙醇将其溶解,后加入5%乙醇2 mL旋涡振荡30 s,待大部分浸膏溶解,用蒸馏水定容至40 mL,40 ℃恒温水浴振荡30 min,再旋涡振荡,重复上述操作,直至提取物充分溶解,制备1 g/mL母液,用蒸馏水将其稀释至相应浓度梯度,高温高压(121 ℃,0.5 MPa,20 min)灭菌,4 ℃冰箱内避光保存备用。

1.2.2 菌悬液的制备 将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌分别接种到营养琼脂培养基上,在37 ℃培养24 h,挑选单一菌落接种到MH肉汤培养基,充分振荡混匀,采用麦氏比浊法[13],用0.5麦氏比浊管调整细菌浓度至1×107cfu/mL;将分离纯化后的真菌菌种分别接种到PDA培养基,28 ℃培养72 h,无菌水洗出,将菌悬液过滤四层纱布过滤后,振荡均匀,用血球计数板计数[14],用无菌生理盐水稀释菌悬液至1×106cfu/mL。

1.2.3 抑菌活性的测定 采用管碟法[15]。取无菌培养皿,每皿倒入约20 mL培养基(细菌:NA;真菌:PDA),吸取200 μL菌液入平板表面,用涂布器将菌液涂布均匀,等距离放置3个已灭菌牛津杯(内径6 mm,外径7.8 mm,高10 mm),向其中2个牛津杯中加入0.5 g/mL质量浓度的植物提取液250 μL,另一牛津杯加入对照液(以0.6 mL 50%乙醇+2 mL 5%乙醇定容至20 mL为对照母液),每种菌做2组平行。细菌于37 ℃ 培养24 h,真菌于28 ℃培养48～72 h(灰霉、链格孢霉72 h,青霉48 h),取下牛津杯,用十字交叉法测量抑菌圈直径,记录数据。对从蓝莓果实中分离得到的3种主要霉菌进行体外抑菌实验,以0.5 g/mL浓度对21种植物提取物进行筛选,根据筛选结果对抑菌效果较为明显的丁香和五味子两种植物提取液分别作不同浓度梯度(0.5、0.2、0.05 g/mL)的抑菌实验,参照贺红宇的方法[16],计算抑制率,探究不同浓度的提取液对病原菌抑制率的影响。计算公式如下:

表1 植物原料及提取率Table 1 Plant material and extraction rate

抑制率(%)=(C-T)/C×100

式中:C-对照菌落直径(mm);T-处理菌落直径(mm)。

1.2.4 最低抑菌浓度(MIC)的测定 根据抑菌活性测定的结果,选取抑菌效果明显的植物提取液进行实验。参照华亚南[17]的方法略作修改。置于恒温摇床中(细菌37 ℃,培养24 h;真菌28 ℃,灰霉、链格孢菌培养48 h,青霉培养36 h)振荡(100 r/min)培养,取出用肉眼观察,不发生浑浊变化(没有悬浮菌落)的最高提取液的稀释倍数后的浓度即为该提取液的MIC值,实验重复3次。

1.2.5 最低杀菌浓度(MBC)的测定 基于最小抑菌浓度(MIC)测定结果,将所有与对照比浊清晰的试管培养液接种于对应平板培养基,细菌37 ℃培养24 h,真菌28 ℃(灰霉、链格孢霉培养48 h,青霉培养36 h)培养,无菌生长的培养皿所对应的提取液稀释管的浓度即是该提取液的最低杀菌浓度(MBC)。

1.2.6 复配提取液抑菌活性的测定 根据单一提取物的抑菌效果,对0.5 g/mL浓度的丁香和五味子,分别以 1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1 (V/V)的比例进行复配实验,按照1.2.3抑菌活性实验方法,测定复配液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、灰霉、链格孢霉和青霉5种病原菌的抑菌圈直径大小。

1.3 数据处理

采用SPSS 22统计软件(美国IBM公司)进行单因素方差分析,表中数值以平均值SD表示,以p<0.05作为差异显著性判断标准,利用Origin 7.5软件(美国OriginLab公司)绘图。

2 结果与分析

2.1 植物原料提取率

从表1可以看出,迷迭香、青花椒、绿茶、丁香4种植物提取物的提取率较高,均超过30%,牛至、金银花、黄芩、八角、五味子、连翘次之,在18%～27%之间,根据抑菌筛选结果和提取率,丁香可作为天然植物源保鲜剂的优先筛选源。

2.2 植物提取液对病菌的抑菌效果

由表2可以看出,丁香对3种霉菌抑制作用均表现最强,抑菌圈直径显著高于其他植物提取物(p<0.05),均超过40 mm。从综合抑菌效果来看,除丁香抑菌效果最好外,厚朴、黄芩和八角也均对3种霉菌有广谱抑菌活性。由表3可以看出,筛选得到对金黄色葡萄球菌有抑菌活性的植物明显多于大肠杆菌,其中五味子对2种细菌的抑制效果最好,对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌圈直径分别达到42.08、28.49 mm,其他抑菌活性较好的植物提取物对这2种细菌抑制作用大小为:八角>绿茶>连翘>丁香>迷迭香>金银花。

表2 植物提取物对病原真菌的抑菌活性Table 2 Antifungal activity of plant extracts against pathogenic fungi

注:表2,表3中“-”表示没有抑菌圈形成;同列不同字母表示差异显著(p<0.05);表6同。

表3 植物提取物对病原细菌的抑菌活性Table 3 Antibacterial activity of plant extracts against pathogenic bacteria

丁香提取物主要抑菌活性成分为丁香酚[18],具有较强的抗氧化、抗真菌效果[19-20]。抑菌活性结果表明,丁香对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌同样有较强抑制效果,Prabuseenivasan等[21]也研究发现丁香精油对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等6种细菌有较好的抑制效果;五味子对多种致病菌具有广谱抗菌作用[22-24],其有效抑菌成分为木脂素类化合物[25],本研究中,五味子对金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)的抑制强度明显高于大肠杆菌(革兰氏阴性菌),推断五味子对革兰氏阳性和阴性细菌有着不同的抑菌机理,可能与青霉素类似,对革兰阳性菌抑制效果较强,对革兰氏阴性菌作用稍弱,闫绍悦等[26]研究得到,五味子提取液对革兰氏阳性和阴性菌均有明显的抑菌活性并对耐药菌也有较稳定的抑菌活性。可见,丁香和五味子可作为研发具有高效、广谱植物源防腐保鲜剂的潜在资源。

2.3 提取液浓度对病菌抑制率的影响

0.5 g/mL浓度的丁香提取液对3种病原真菌的抑制效果见图1,3种霉菌牛津杯周围都有明显的抑菌区域形成,对青霉的抑菌圈较为规则;0.5 g/mL的五味子提取液对2种致病菌的抑制效果见图2,对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌都有明显且规则的抑菌圈形成。由图3对比结果可以看出,0.5 g/mL的丁香提取液对3种霉菌的抑制效果最好,抑制率均超过50%,随着浓度的降低,对3种霉菌的抑制作用均出现不同程度下降。在0.05 g/mL时,丁香提取液对3种霉菌的抑制率在20%左右;对灰霉的抑制率随浓度变化较链格孢霉和青霉下降明显;由图4看出,0.5 g/mL五味子提取液对金黄色葡萄球菌的抑制率超过50%,对大肠杆菌的抑制率略差,五味子提取液在高浓度梯度变化时对2种细菌抑制率同样影响较大,低浓度梯度影响幅度不大。不同浓度梯度变化与病原菌的抑制效果没有成比例关系可能与提取液中有效抑菌成分的变化及不同病原菌对提取物耐药性相关。

图1 丁香对灰霉(1)、链格孢霉(2)、青霉(3)的抑制效果Fig.1 Inhibitory effect of clove extract on Botrytis cinerea(1), Alternaria alternata(2)and Penicillium sp.(3)

图2 五味子对金黄色葡萄球菌(4)、大肠杆菌(5)的抑制效果Fig.2 Inhibitory effect of Fructus schisandrae extract on Staphylococcus aureus(4)and Escherichia coli(5)

图3 不同浓度丁香提取液对真菌的抑制率Fig.3 Different concentration of clove extract on fungi inhibition rate

图4 不同浓度五味子提取液对细菌的抑制率Fig.4 Different concentration of Schisandra chinensis extract on bacteria inhibition rate

2.4 最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)

从表4可以看出,丁香对灰霉(Botrytiscinerea)、链格孢霉(Alternariaalternata)和青霉(Penicilliumsp.)的MIC值和MBC值均最低,与抑菌活性测定实验结果一致。其中丁香对灰霉的MIC为15.63 mg/mL,MBC为31.25 mg/mL,其次为广藿香;其他植物提取物对灰霉的MIC和MBC较表2表征效果略有不同,可能与抑菌接触方式的差异相关;丁香对链格孢霉的MIC和MBC分别为31.25和62.5 mg/mL;绿茶、五味子对链格孢霉的抑菌效果相对较弱,厚朴、八角、黄芩介于两种抑菌强度之间;丁香对青霉的MIC和MBC分别为31.25和62.5 mg/mL,八角、百里香、黄芩对青霉的MIC和MBC测定结果与表2抑菌活力相比存有差异,剩余提取物抑菌能力都较弱与表2抑菌活力基本一致。

由表5结果可知,五味子对2种细菌的抑菌效果最强,对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的MIC分别为31.25和62.5 mg/mL,MBC分别为62.5和125 mg/mL,其他提取物对2种细菌的MIC值和表3抑菌效力结果相一致,八角、丁香对这2种细菌有相同的MIC和MBC,连翘、迷迭香、绿茶对金黄色葡萄球菌的最低抑菌活力稍强于大肠杆菌。

表4 植物提取物对病原真菌的MIC和MBCTable 4 MIC and MBC of plant extracts against pathogenic fungi

注:表中“-”表示无最低效力。

2.5 复配提取液的抑菌效果

表6 复配提取液的抑菌活性Table 6 Antimicrobial activity of compound extracts

由表6可知,丁香和五味子复配比例的调整对3种霉菌的抑菌效力没有表现出协同增效的作用,起主要抑菌效力的为丁香。随着丁香比例的增大,对3种霉菌的抑菌圈直径均呈不同梯度扩大,复配液在5∶5比例后对灰霉和青霉的抑菌直径增幅较为明显,比例在9∶1时对3种霉菌的抑制能力达到最大,但抑菌圈直径仍低于0.5 g/mL单独使用丁香的抑菌效力。复配液的个别比例区间对2种细菌的抑菌效力出现不同程度的影响变化,6∶4配比对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径较前后配比增大显著(p<0.05),表现出局部比例区间增效作用,之后抑菌效力递减,而5∶5配比对大肠杆菌的增效抑制作用更为显著(p<0.05),达到所有配比中最好的抑制效果。

总之,丁香和五味子两种提取液的复配对5种不同病原菌呈现出不同变化的抑菌效力,但由抑菌效果可知,复配液扩大了较单一提取液的抑菌谱范围,保证具有显著抑菌效果的同时,减少了每种单剂使用浓度和用量,在蓝莓鲜果贮运中影响保鲜品质的主要为病原霉菌,因此为更加有效抑制主要霉菌的生长,丁香和五味子两种提取液大于5∶5比例可作为制备蓝莓贮运保鲜剂较佳的复配参考。

3 结论

从迷迭香、青花椒、绿茶等21种植物乙醇提取物中筛选出丁香、八角、黄芩等植物提取物对灰霉、链格孢霉和青霉3种病原真菌有不同强度的抑制效果,五味子、八角、连翘等植物取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌2种贮运致病细菌有抑制效果。其中,丁香对3种真菌的抑菌能力最明显。0.5 g/mL丁香提取液对3种霉菌的抑制率均超过50%,对灰霉的MIC为15.63 mg/mL,MBC为31.25 mg/mL,对链格孢霉和青霉的MIC和MBC值相同,分别为31.25和62.5 mg/mL;五味子对2种细菌的抑制能力最强,其次为八角、连翘和绿茶,五味子对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的MIC分别为31.25和62.5 mg/mL,MBC分别为62.5和125 mg/mL。提取液浓度的变化对病菌的抑制能力影响较大,浓度梯度的变化对不同病菌的抑菌效果也有所差异。

对丁香、五味子2种分别对病原真菌和致病细菌具有最强抑菌能力的提取液复配,产生的复配抑菌效力有所不同,一定比例的复配液对2种细菌的抑菌效力呈现出协同增效作用,对真菌则没有表现出增效,丁香和五味子的比例在5∶5以上可作为制备蓝莓贮运保鲜剂的较佳复配参考。

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Inhibitoryeffectofnaturalplantcrudeextractsonthepathogenicbacteriaofblueberryduringstorageandtransportation

WANGWei1,YANGXiu-lian1,YUANHong-yan2,LINShu-hua2,ZHANGJu-hua2,*

(1.Longping Branch,Graduate School of Hunan University,Changsha 410125,China;2.Hunan Agricultural Sciences Academy of Agricultural Products Processing Institute,Changsha 410125,China)

To screen out the natural preservative with good fresh-keeping effect on blueberry fruit during storage and transportation. In this study,21 kinds of plant crude extracts were used to investigate the antimicrobial activities of 3 pathogenic fungi isolated from blueberry during storage and 2 common foodborne pathogenic bacteria in the logistics by Oxford cup method and the minimal inhibitory concertration(MIC)and minimal bactericidal concentration(MBC)of these plant extracts were determined. Besides,the effect of concentration of extracts on the inhibition rate of pathogens was studied and the bacteriostatic activity of the compound extracts were tested. The results showed that clove has the strongest inhibitory ability,and the average inhibitory circle diameters ofBotrytiscinerea,AlternariaalternataandPenicilliumsp. were 47.58,39.68,40.54 mm,respectively,and the MICs of clove against these 3 fungi were 15.63,31.25,31.25 mg/mL,the MBCs were 31.25,62.5,62.5 mg/mL. The antibacterial effect of Schisandra chinensis againstStaphylococcusaureusandEscherichiacoliwas obviously higher than the other extracts,the average inhibitory circle diameter on the 2 kinds of bacteria was 42.08,28.49 mm,the MICs were 31.25,62.5 mg/mL,the MBCs were 62.5,125 mg/mL. Two extracts of clove andSchisandrachinensis,which were the strongest inhibitory effect on Blueberry pathogenic fungi and bacteria,respectively,were screened out and the Change of these two kinds of extract concentration gradient inhibition effect on different pathogens are different,the larger effect of high concentration,besides,clove and schisandra compound ratio greater than 5∶5 can be used as a better blueberry preservative application reference.

blueberry;storage and transportation pathogen;plant crude extracts;antimicrobial activity;compound extract

2017-06-13

王伟(1990-),男,硕士研究生,研究方向:果蔬贮藏保鲜,E-mail:davekingww@126.com。

*通讯作者:张菊华(1971-),女,硕士，研究员,研究方向:果蔬贮藏与加工,E-mail:zhangjuhua99@163.com。

国家科技支撑计划(2015BAD16B01);湖南省重点研发计划(2016NK2182)。

TS255.3

A

1002-0306(2017)23-0232-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.23.043