超声提取食用玫瑰花总酚及其大孔树脂纯化前后抗氧化活性

, ,, ,,,,*

(1.昆明理工大学食品安全研究院,云南昆明 650500;2.昆明市农业科学研究院,云南昆明 650231)

超声提取食用玫瑰花总酚及其大孔树脂纯化前后抗氧化活性

蒋孟君1,王艺2,任建青2,叶玉2,程桂广1,赵天瑞1,曹建新1,*

(1.昆明理工大学食品安全研究院,云南昆明 650500;2.昆明市农业科学研究院,云南昆明 650231)

以昆明安宁八街食用玫瑰为原料,对其多酚提取工艺及纯化前后抗氧化活性进行研究。结果表明,提取温度是影响食用玫瑰多酚提取效果的主要因素;超声提取的最佳条件为乙醇体积分数70%、提取温度40 ℃、料液比1∶25 (g/mL)、提取3次，提取时间每次40 min,经实验验证此条件下总多酚含量为93.81 mg/g;通过9种树脂静态吸附及解析性能比较,确定XAD-7型树脂为多酚分离纯化的理想树脂;对比纯化前后玫瑰花多酚对DPPH自由基、ABTS自由基的氧化能力,纯化前对DPPH自由基和ABTS自由基清除能力IC50值分别为209.27、505.67 μg/mL;纯化后分别为96.30、378.09 μg/mL;结果表明玫瑰花多酚经XAD-7型大孔树脂纯化后能提高其抗氧化活性。

食用玫瑰花,多酚,提取工艺,大孔树脂纯化,抗氧化活性

蔷薇科植物玫瑰(RosarugosaThunb)是一种具有较高食用价值和经济价值的药用植物[1],其成分十分丰富,约有300多种,含有多酚、可溶性糖、有机酸、黄酮类等小分子活性物质[2]。其中多酚类化学成分具有清除自由基、抗炎、抑菌、降血脂和预防心脏病等生理活性[3]。随着天然产物开发的不断深入,植物多酚已成为最具潜在开发价值的天然抗氧化剂来源,其抗氧化活性的研究也备受关注[4-6]。

利用超声产生的热效应、机械作用使植物细胞内可溶性物质快速释放、扩散并溶解进入溶剂中,同时可以较好地保持提取物的结构和活性,具有时间短、提取率高[7],消耗溶剂少、避免高温对有效成分的破坏等特点,对酚类等热敏性物质,超声提取优势尤为明显[8]。大孔树脂是一种常用有效的分离纯化多酚物质的方法[9],这种技术因为成本低、选择性好、效率高、毒性小等特点而具有很好的应用前景[10]。目前对玫瑰花的研究大多停留在玫瑰花精油[11]、黄酮[12]、多糖[13]、原花青素[14]的提取、生物活性等研究上,对可食用玫瑰花多酚经大孔吸附树脂纯化前后的抗氧化活性研究尚未见报道。

因此,本文以盛产于云南昆明安宁市八街镇的食用玫瑰(Rosachinensis‘An Ning Ba Jie’)为原料,采用超声提取法提取其中的多酚,运用正交实验优化提取工艺,通过大孔树脂作用于玫瑰花多酚类物质的静态吸附-解析研究,筛选纯化多酚的理想树脂,并对纯化前后玫瑰多酚的抗氧化活性进行研究,研究结果为有效开发利用食用玫瑰花多酚,发挥其最大经济效益提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

食用玫瑰花 采自安宁市八街镇,经冷冻干燥48 h,粉碎过40目筛后保存于-80 ℃冰箱备用;LSD-296、NKA-2、LSD-762、AB-8、HPD-TSD、XAD-7、HPD-100、XAD-16、NKA-9型大孔吸附树脂 天津海光化工有限公司;DPPH、ABTS、TPTZ 美国Sigma公司;无水乙醇、甲醇 均为国产分析纯;实验用水 均为超纯水。

ZD-F12真空冷冻干燥机 南京载智自动化设备有限公司;AL204型电子天平 梅特勒-托利多(上海)有限公司;SpectraMax M5 多功能酶标仪 美国Molecular Devices公司;TDL-40B型离心机 上海安亭科学仪器厂;SCQ-数控加热超声波清洗机 上海声彦超声波仪器有限公司;UPHW-I-90T优普系列超纯水机 成都超纯科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 没食子酸标准曲线的建立 参照Folin-Ciocalteu法[15],在波长765 nm处使用多功能酶标仪测定吸光值,以没食子酸标准溶液浓度为横坐标(X),对应的吸光值为纵坐标(Y),绘制标准曲线。

1.2.2 玫瑰花多酚的提取与测定 准确称取玫瑰花粉末1.00 g于烧杯中,在各因素考察条件下提取玫瑰花多酚,于50 Hz超声波清洗机中,重复提取三次。将提取液在5000 r/min的离心机中离心分离15 min后取上清液定容至50 mL,即为玫瑰花多酚提取液。然后按照绘制标准曲线步骤操作,测定样品中的吸光值,按下式计算样品:

式中:C:样液中多酚的含量 μg/mL;V:样液的体积 mL;W:玫瑰粉末质量 g;N:稀释倍数。

1.2.3 玫瑰花多酚提取的单因素实验

1.2.3.1 提取溶剂对多酚提取量的影响 在提取时间30 min,料液比1∶25 (g/mL),超声温度40 ℃条件下,考察不同溶剂乙醇、超纯水、甲醇、丙酮对总多酚含量的影响。

1.2.3.2 乙醇浓度对多酚提取量的影响 在提取时间30 min,料液比1∶25 (g/mL),超声温度40 ℃条件下,考察乙醇浓度40%、50%、60%、70%、80%、90%对总多酚含量的影响。

1.2.3.3 提取次数对多酚提取量的影响 用70%乙醇在提取时间30 min,料液比1∶25 (g/mL),超声温度40 ℃条件下,分别考察提取次数1、2、3、4次对总多酚含量的影响。

1.2.3.4 料液比对多酚提取量的影响 在乙醇体积分数70%,超声温度40 ℃、时间30 min条件下,分别考察料液比1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 (g/mL)对总多酚含量的影响。

1.2.3.5 提取温度对多酚提取量的影响 在乙醇体积分数70%,超声30 min,料液比1∶25 (g/mL)条件下,分别考察温度30、35、40、45、50 ℃对总多酚含量的影响。

1.2.3.6 提取时间对多酚提取量的影响 在乙醇体积分数70%、料液比为1∶25 (g/mL)、超声温度40 ℃条件下,分别考察超声10、20、30、40、50 min对总多酚含量的影响。

1.2.4 正交实验 在单因素实验的基础上,选取提取次数、料液比、温度、提取时间为影响因素,选用正交表L9(34)进行实验,正交实验因素与水平见表1。

表1 正交实验因素与水平Table 1 Factors and levels table of orthogonal experiment

1.2.5 大孔树脂对多酚的纯化工艺

1.2.5.1 大孔吸附树脂预处理 取9种不同型号的适量大孔树脂用95%乙醇浸泡24 h,待其充分溶胀后,用70%乙醇反复淋洗,至加超纯水不浑浊后。用超纯水冲洗至无乙醇味,将树脂过滤,备用[16]。

1.2.5.2 树脂的筛选 参照文献[17]的方法,略有改动。分别称取不同型号滤干树脂2.00 g置于30 mL锥形瓶中,分别加入20 mL多酚粗提液,置于120 r/min摇床,静态吸附24 h,取上清液测定多酚含量,计算吸附率。取吸附饱和的树脂,吸干其表面水分,加入70%乙醇溶液20 mL,静态解析24 h,取上清液测定多酚含量,计算解析率。吸附率和解析率计算公式如下[18]:

式中:C0:提取液中玫瑰多酚的初始浓度(mg/g);C1:吸附平衡时多酚浓度(mg/g);C2:解析后乙醇洗脱液中的多酚浓度(mg/g);V1:上样前体积(mL);V2:解析后体积(mL)。

1.2.5.3 吸附动力学实验 取2.00 g滤干树脂于20 mL玫瑰多酚提取液中,避光振荡吸附(25 ℃、120 r/min),每1 h取溶液,测其多酚含量,计算吸附量。以时间为横坐标,吸附量为纵坐标绘制吸附动力学曲线。吸附量公式如下:

式中:C0:提取液中玫瑰多酚的初始浓度(mg/g);C1:吸附平衡时多酚浓度(mg/g);V1:上样前体积(mL)。

1.2.6 玫瑰多酚纯化前后抗氧化实验

1.2.6.1 DPPH自由基清除实验 参照文献[19]的方法,略作改动。精确吸取0.4 mL不同浓度待测样品,于5 mL离心管中,加入2.0 mL 0.1 mmol/L DPPH·反应液,混匀,避光反应30 min,在波长为517 nm处测吸光值,以无水乙醇做试剂空白,测定空白样吸光值。玫瑰花多酚对DPPH自由基清除率按下式计算:

式中:A0:0.4 mL 无水乙醇+2.0 mL DPPH·溶液;A1:0.4 mL 样品+2.0 mL 无水乙醇;A2:0.4 mL 样品+2.0 mL DPPH·溶液。

1.2.6.2 ABTS自由基清除实验 参照文献[20]的方法,略做改动。取0.5 mL不同浓度的样品与4.0 mL ABTS+工作液混匀,30 ℃水浴6 min,在波长734 nm处测吸光值,以无水乙醇做试剂空白,测定空白样吸光值。ABTS自由基清除率按下式计算:

式中:A0:0.5 mL超纯水+4.0 mL ABTS+·工作液;A1:0.5 mL样品+4.0 mL乙醇;A2:0.5 mL样品+4.0 mL ABTS+·工作液。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 标准曲线

以没食子酸标准溶液浓度为横坐标(X),对应的吸光值为纵坐标(Y),绘制标准曲线,得回归方程为Y=56.438X+0.054,R2=0.9985。

2.2 单因素实验

2.2.1 提取溶剂对多酚提取量的影响 由图1可知,不同溶剂对玫瑰花多酚含量有影响,用乙醇或甲醇提取玫瑰花多酚含量与用水或丙酮提取的含量差异显著(p<0.05)。提取溶剂为乙醇时,玫瑰多酚的提取率最高,其次是甲醇,从实际生产考虑乙醇毒性较小,廉价,故选取乙醇作为提取溶剂。

图1 溶剂种类对玫瑰花总多酚含量的影响Fig.1 Effect of solvent type on total polyphenol content from rose注:小写字母不同表示总多酚含量差异显著(p<0.05),图2～图6同。

2.2.2 乙醇浓度对多酚提取量的影响 由图2可知,随乙醇体积分数的升高,多酚含量先增加后趋于平缓,这可能由于乙醇浓度低时,无法破坏样品中多酚类物质与蛋白、多糖或其他物质的连接,多酚得率低;随着乙醇浓度的增加,多酚类物质在乙醇溶液中的溶解度增加,但是乙醇体积分数过高时,脂溶性成分浸出较多,不利于多酚类物质的提取[21]。再结合统计学分析,乙醇浓度从70%往上增加,多酚提取量差异不显著,故选择70%乙醇作为提取剂。

图2 乙醇浓度对玫瑰花总多酚含量的影响Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on total polyphenol content from rose

2.2.3 提取次数对多酚提取量的影响 由图3可知,随着提取次数的增加,玫瑰多酚的提取率逐渐增加,多酚含量经1、2、3次提取有显著差异(p<0.05),但提取4次与提取3次差异不显著(p>0.05)。从节省时间、溶剂、能源方面考虑,选取2次提取为正交实验的提取次数中心值。

图3 提取次数对玫瑰花总多酚含量的影响Fig.3 Effect of extraction times on total polyphenol content from rose

2.2.4 料液比对多酚提取量的影响 由图4可知,玫瑰花多酚含量随料液比降低而升高。料液比为1∶15 (g/mL)时,总酚含量为59.13 mg/g;当料液比达到1∶30 (g/mL)时,总酚含量为79.80 mg/g,显著高于料液比1∶15 (g/mL)(p<0.05);此后再降低料液比,总酚含量增加不显著(p>0.05),且料液比过小会为后续的浓缩操作带来不便,故选取1∶30 (g/mL)为正交实验的料液比中心值。

图4 料液比对玫瑰花总多酚含量的影响Fig.4 Effect of solid-to-liquid ratio on total polyphenol content from rose

2.2.5 提取温度对多酚提取量的影响 由图5可知,在30～45 ℃之间时,随着提取温度的升高,多酚含量逐渐增加,差异显著(p<0.05),这是因为增加温度可加快溶质中多酚的扩散速率,酚类物质更容易从原料中提取出来[19]。在45 ℃以后,多酚含量降低,无显著差异,这可能是由于温度过高,热不稳定性、挥发性成分易被破坏、挥发,使得提取量降低。故选取45 ℃为正交实验的提取温度中心值。

图5 温度对玫瑰花总多酚含量的影响Fig.5 Effect of temperature on total polyphenol content from rose

图6 提取时间对玫瑰花总多酚含量的影响Fig.6 Effect of extraction time on total polyphenol content from rose

2.2.6 提取时间对多酚提取量的影响 由图6可知,当提取时间为10～30 min,总酚含量随时间延长而提高,差异极显著(p<0.01),此后再延长提取时间,总酚含量有所减少,差异显著(p<0.05),这可能是玫瑰中的其他醇溶性成分溶出,多酚可能会分解掉。故选取30 min为正交实验的提取时间中心值。

2.3 玫瑰多酚提取工艺的正交实验结果与分析

在单因素分析的基础上,提取次数、料液比、温度、时间4个因素,选用正交表L9(34)进行正交实验,实验结果如表2所示。

表2 正交实验设计及结果Table 2 Results of the orthogonal experiment

由表2可知,经过均值和极差分析与比较,在选定范围内,玫瑰花总多酚提取影响因素的主次关系分别为C(温度)>D(时间)>A(次数)>B(料液比)。最优因素组合为C1D3A3B1,即温度40 ℃、提取时间40 min、提取3次、料液比1∶25 (g/mL)时为最佳提取条件。进一步由表3的方差分析结果可知,温度对玫瑰花总多酚含量有显著性影响,而时间、提取次数和料液比对该过程无显著性影响。

表3 正交实验方差分析表Table 3 Variance analysis of the orthogonal experiment

注:F0.01(2,8)=19.37,F0.05(2,8)=9.37;当F>F0.05时,差异显著,用*表示。

2.4 验证实验

因最佳因素组合为C1D3A3B1,不在正交表中,所以需要对最佳因素进行验证实验,即精确称取玫瑰花粉末1.00 g,以1∶25 (g/mL)的料液比加入70%乙醇、40 ℃条件下超声提取3次,每次40 min,得到玫瑰花多酚的含量为92.38、95.42、93.63 mg/g,平均多酚含量为93.81 mg/g,RSD值为1.53 mg/g,可以看出该工艺比较稳定,可达到优化的目的,结果与文献[22]报道的接近。

2.5 纯化工艺

大孔吸附树脂被广泛用于多酚类物质的分离与富集[23],但其吸附性能及其解析、纯化条件参数因所分离物质的理化性质不同而不同[24]。由图7可知,通过9种树脂静态吸附及解析性能比较,XAD-7和XAD-16型树脂对玫瑰多酚均具有较高的吸附率和解析率,且无显著差异。还需通过吸附动力学实验,进一步筛选理想的树脂。

图7 大孔树脂的吸附及解析性能Fig.7 Macroporous resin adsorption and analytical properties注:大写字母不同表示吸附率差异显著(p<0.05);小写字母不同表示解析率差异显著(p<0.05)。

由图8可知,XAD-16型树脂在起始阶段吸附量较小,在8 h达到吸附平衡;XAD-7型树脂在1～7 h内,随着时间增加,树脂对玫瑰多酚的吸附量逐渐增大,差异显著(p<0.05),在5 h达到吸附平衡,无显著差异。综上,对比XAD-7和XAD-16型树脂的吸附量性能,选择XAD-7型树脂对玫瑰花多酚进行纯化。

图8 大孔树脂静态吸附动力学曲线Fig.8 Static adsorption kinetics curve of macroporous resin

2.6 纯化前后玫瑰花多酚抗氧化活性的测定

2.6.1 纯化前后玫瑰花多酚对DPPH自由基的清除效果 DPPH自由基是一种稳定的自由基,能接受电子或氢自由基,形成稳定的反磁性分子,抗氧化剂对DPPH自由基的清除原理,是基于它的供氢能力[25]。由图9可知,随着多酚浓度的增加,其DPPH自由基清除率不断升高,差异显著(p<0.05)。在相同浓度下,纯化后多酚较纯化前对DPPH自由基的清除能力强。纯化前后玫瑰花多酚对DPPH自由基清除能力IC50值分别为209.27 μg/mL和96.30 μg/mL,说明经XAD-7大孔树脂纯化后的玫瑰花多酚对DPPH自由基的清除能力强于粗多酚,这可能是因为经XAD-7大孔树脂处理后玫瑰花多酚得到纯化和富集[22]。

图9 多酚纯化前后对DPPH自由基的清除效果Fig.9 Removal of DPPH free radicals before and after polyphenol purification

2.6.2 纯化前后玫瑰花多酚对ABTS+自由基的清除效果 蓝绿色的ABTS+自由基稳定性高,当存在具有供氢能力的抗氧化剂时,可使其还原成无色的ABTS,根据ABTS+自由基溶液前后吸光度的变化可测定样品的抗氧化能力[26]。由图10可知,随着多酚浓度的增加,其ABTS+自由基清除率不断升高,差异显著(p<0.05)。在相同浓度下,纯化后多酚对ABTS+自由基的清除能力均强于粗多酚,与DPPH自由基的清除结果一致。纯化前后玫瑰花多酚对ABTS自由基清除能力IC50值分别为505.67 μg/mL和378.09 μg/mL,说明纯化后的玫瑰花多酚具有较强的清除ABTS自由基的能力。

图10 多酚纯化前后对ABTS+自由基的清除效果Fig.10 Removal of ABTS+ free radicals before and after polyphenol purification

3 结论

通过单因素实验和正交实验,确定提取玫瑰花总酚的最佳工艺条件为:70%乙醇超声提取,提取时间40 min,提取3次,料液比1∶25 (g/mL),温度40 ℃,在此条件下总酚含量为93.81 mg/g。利用XAD-7型树脂对玫瑰花总酚进行分离纯化,再对纯化前后多酚提取液进行抗氧化实验。结果表明:纯化前对DPPH自由基和ABTS自由基清除能力IC50值分别为209.27 μg/mL和505.67 μg/mL;纯化后分别为96.30 μg/mL和378.09 μg/mL,说明超声提取的玫瑰花多酚经XAD-7型大孔树脂处理后,对DPPH、ABTS自由基清除能力均有所提高。这将为可食用玫瑰花在食品、保健品行业的深入开发提供基础数据。

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Studyonultrasonicextractionoftotalphenolfromedibleroseandantioxidantactivityofmacroporousresinbeforeandafterpurification

JIANGMeng-jun1,WANGYi2,RENJian-qing2,YEYu2,CHENGGui-guang1,ZHAOTian-rui1,CAOJian-xin1,*

(1.Yunnan Institute of Food Safety,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650500,China;2.Kunming Academy of Agricultural Sciences,Kunming 650231,China)

Rosachinensis‘An Ning Ba Jie’ as the raw material,the extraction process of polyphenol and the antioxidant activity before and after purification were studied. The extraction temperature were identified as main factor that influence extraction efficiency. The optimum conditions for the ultrasonic extraction of polyphenols from rose were found to be with 70% ethanol at solid-to-liquid ratio 1∶25 (g/mL)for 40 min with ultrasonic temperature 40 ℃with extraction three times. Under these conditions,the extraction of total phenol was 93.81 mg/g. The XAD-7 resin was found to be the ideal resin for the purification of phenolics from rose by comparing the static adsorption and analytical properties of nine resins. Before purification of DPPH and ABTS free radical scavengingIC50values were 209.27 μg/mL and 505.67 μg/mL,after purification,they were 96.30 μg/mL and 378.09 μg/mL,respectively. The results showed that rose polyphenols could enhance their antioxidant activity after purification by XAD-7 macroporous resin.

edible rose;polyphenols;extraction technology;macroporous resin purification;antioxidative activity

2017-06-03

蒋孟君(1994-)，女，硕士研究生，研究方向：天然药物化学，E-mail:jiangmj0327@163.com。

*通讯作者:曹建新(1969-)，女，博士，教授，研究方向：天然药物化学，E-mail:jxcao321@hotmail.com。

国家自然科学基金( 31600274，31460083)；昆明安宁八街食用玫瑰成分分析(KKF0201562034)。

TS201.1

B

1002-0306(2017)23-0164-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.23.031