群体感应抑制剂3,4二溴2(5H)呋喃酮对荧光假单胞菌生物膜形成的抑制作用

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(1.宁波市食品检验检测研究院,浙江宁波 315000;2.中国计量大学生命科学学院,浙江杭州 310018)

邢家溧1,2,陈珊珊2,周子焱1,沈坚1,傅晓1,马超毅2,陆昭君2,施悦岚2,汪艺2,戴贤君2,郑睿行1,*

(1.宁波市食品检验检测研究院,浙江宁波 315000;2.中国计量大学生命科学学院,浙江杭州 310018)

为了研究3,4-二溴-2(5H)-呋喃酮(3,4-dibromo-2(5H)-furanone,DF)对荧光假单胞菌生物膜形成的抑制作用。通过在24孔板和硅胶片上构建生物膜模型,CFU计数法测定DF对荧光假单胞菌的最低抑制浓度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)和最低杀菌浓度(Minimum Bacterial Concentration,MBC)以及生物膜生长曲线,在1倍MIC和5倍MIC的DF作用下的荧光假单胞菌生物膜形成率和细菌群集运动能力,并探讨DF对荧光假单胞菌总蛋白合成及多糖含量的影响。结果表明,DF对荧光假单胞菌作用的MIC和MBC值分别为12.5 μg/mL和800 μg/mL;在DF浓度为1 MIC和5 MIC时,作用于荧光假单胞菌24 h生物膜形成抑制率分别为20.59%±2.91%和99.54%±1.83%,并能明显抑制荧光假单胞菌的群集运动能力,干扰荧光假单胞菌群体感应(Quorum sensing,QS)系统而影响其总蛋白合成及多糖的含量,24 h时5 MIC的DF对荧光假单胞菌总蛋白和菌多糖合成量的抑制率分别为8.04%±0.37%和51.08%±2.71%。本研究对DF影响荧光假单胞菌生物膜形成的原因,DF对荧光假单胞菌生物膜形成的抑制作用及其对QS通路的干扰具有良好的理论和实践参考。

3,4-二溴-2(5H)-呋喃酮,荧光假单胞菌,生物膜,抑制作用

细菌生物膜(Biofilm,BF)的形成是细菌在营养物质缺乏时,通过群体感应(Quorum sensing,QS)系统在信号分子的调控下分泌的细胞外基质物质如多糖、蛋白质和DNA等多聚物质[1],BF将细菌本身包裹于其中,从而使细菌易粘附于惰性或活性材料表面,如加工设备等[2]。据美国国立卫生研究院(National Institutes of Health,NIH)统计发现,超过八成的细菌性疾病是由于菌体生物膜的形成[3]。在食品工业中,由于生物膜的普遍性、形态结构和生化特性的特殊性,食源性病原菌和腐败菌往往能黏附于厂房地板和天花板、输送管道、不锈钢等材料表面形成生物膜,有效避开宿主免疫作用、抗生素杀伤作用,并且产生耐药性,成为潜在的食品污染源,是食品安全的重大隐患[4]。

荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)属于假单胞菌属的无芽孢、无荚膜、有极端鞭毛的革兰氏阴性菌[5],作为嗜冷菌,在生活生产中应用广泛,能产生抗生素、水解酶等代谢产物,可以通过形成生物膜减少来自外界的影响,是冷藏食品腐败的优势菌,是牛奶中危害最大的微生物,此外荧光假单胞菌在生产设备表面形成的生物膜难以清除,对食品生产可能带来持续污染[6]。因此,防治荧光假单胞菌生物膜的形成及其相关危害成为目前研究的前沿和热点。

研究表明,3,4-二溴-2(5H)-呋喃酮(3,4-dibromo-2(5H)-furanone,DF)可以与细菌分泌的自诱导物竞争性结合自诱导物受体,通过作用于细菌的QS系统影响细菌生物膜的形成,是一种QS通路抑制剂[5,7]。本研究旨在通过研究DF对荧光假单胞菌生物膜形成的影响,探究其对荧光假单胞菌生物膜形成的抑制作用和效果及其对QS通路的干扰。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

荧光假单胞菌 由本实验室分离鉴定并保存于中国计量大学生物检测与食品安全研究所;L-肉汤培养基(LB) 杭州百思生物技术有限公司;DF Sigma公司;医用硅胶片、移液枪、0.45 μm微孔滤膜、24孔板、二甲亚砜、0.4%结晶紫、PBS(pH7.3)、2.5%戊二醛PBS溶液、饱和氯化钙溶液、5%硝酸银溶液 杭州米克化工有限公司。

CR60DF立式自动压力蒸汽灭菌器 厦门致薇仪器有限公司;BJ-2CD超净工作台 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;I3型紫外可见分光光度计 济南荷能仪器股份有限公司;LT-BIX低温生化培养箱 上海立德泰勀科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株的活化和硅胶引导片的处理

1.2.1.1 菌株的活化 荧光假单胞菌在含30%(v/v)甘油的LB培养基中,-80 ℃冻存。使用前按1%(v/v)接种量接于LB液体培养基,28 ℃静置培养18 h,连续活化2次。

1.2.1.2 硅胶引导片的处理 将1 cm×1 cm医用硅胶引导片先用去离子水冲洗,再于丙酮中60 W超声15 min;然后把它们放在75%的乙醇中浸泡30 min,洗涤剂清洗,并用蒸馏水冲洗干净,最后121 ℃灭菌20 min。

1.2.2 DF作用荧光假单胞菌的最低抑制浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)的测定 采用二倍稀释法,将不同浓度的DF(6.25、12.5、25、50、100、200、400、800和1000 μg/mL,50 μg)加入到含荧光假单胞菌(初始OD为0.05,50 μL)的5 mL LB液体培养基的试管中,28 ℃下培养24 h后,测其OD600,平行测定3次。

1.2.3 DF对荧光假单胞菌生物膜影响

1.2.3.1 DF对荧光假单胞菌浮游菌生长曲线及生物膜生长曲线的影响 取培养24 h处于对数生长期的荧光假单胞菌液稀释成菌悬液,OD600为0.5,取1%接种于5 mL培养液中,并分别加入0.05 mL的1MIC与5MIC的DF,以不加DF的为对照组,28 ℃恒温振荡培养,每隔4 h测菌落OD600,绘制浮游菌菌落生长曲线,平行实验3次;

取培养24 h处于对数生长期的荧光假单胞菌液稀释成菌悬液,OD600为0.5,24孔板每孔接种1 mL 1%菌液,分别加入0.05 mL的1MIC与5 MIC的DF,同等大小硅胶片一片。28 ℃培养,分别于0、6、12、24、36、48、72 h取出硅胶引导片置于试管中,加3 mL无菌水超声20 min,涡旋3 min,测OD600,并在倍比稀释后进行CFU计数,平行实验3次,绘制生物膜曲线。

1.2.3.2 群集运动能力测定 制备测定群集运动能力平板,添加0.05 mL 5 MIC的DF为实验组,以不含DF的培养基作为空白对照。用灭菌牙签挑取固体LB培养基上过夜培养的单菌落,扎透培养基,将细菌接种到培养基下面的塑料平皿上,28 ℃下恒温培养24 h。

1.2.3.3 DF作用下的荧光假单胞菌生物膜银染鉴定及抑制率 向24孔板中每孔加入1 mL LB培养基、灭菌硅胶引导片、10 μL菌液(OD600为0.5),分别加入10 μL的1MIC与5MIC的DF为实验组,以不含DF的培养基作为对照组,28 ℃培养24 h后取出菌悬液,测其OD600,然后轻轻洗孔,室温干燥30 min,加入1 mL 1%结晶紫染色,室温放置15 min后取出染液,蒸馏水洗孔两次,室温干燥30 min,加入1 mL的95%乙醇进行溶解,测其OD600,用银染法鉴定荧光假单胞菌生物膜的状态[8]。

1.2.4 DF对细菌总蛋白合成、生物膜胞外多糖含量的影响 取培养24 h处于对数生长期的荧光假单胞菌液稀释成菌悬液,OD600为0.5,取1%接种于5 mL培养液中,加入0.05 mL的1MIC与5 MIC的DF,28 ℃恒温振荡培养,每隔4 h提菌总蛋白并用考马斯亮蓝法测定[9],绘制总蛋白含量曲线;取培养24 h处于对数生长期的荧光假单胞菌液稀释成菌悬液,OD600为0.5,取1%接种于5 mL培养液中,加入0.05 mL的1MIC与5MIC的DF,28 ℃恒温振荡培养,每隔4 h用EDTA溶剂法提取多糖,采用苯酚硫酸法测定多糖含量[10],绘制多糖含量曲线。

表1 溴代呋喃酮对荧光假单胞菌的1MIC和MBC值Table 1 1MIC and MBC values of bromo-furanone inhibiting the growth of Pseudomonas fluorescens

1.3 数据处理

采用Excel 2003和SPSS 13.0数据统计软件处理实验数据,每个实验重复3次。采用SPSS的单因素方差分析(ANOVA)样品的显著性差异。单因素ANOVA分析用SPSS和Fisher’s least significant difference(LSD)表明样品间显著差异,只有当p<0.05时被认定为数据具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 溴代呋喃酮对荧光假单胞菌抑制作用的MIC和MBC值

通过溴代呋喃酮对荧光假单胞菌抑制作用的MIC和MBC值测定,从表1可以看出,当DF浓度低于12.5 μg/mL时,6.25 μg/mL的OD600与对照组无显著差异(p>0.05),而12.5 μg/mL的OD600显著(p<0.05)低于对照组,这表明低于12.5 μg/mL的DF对荧光假单胞菌无抑制作用,当DF浓度高于800 μg/mL时,DF对荧光假单胞菌的抑制作用不再增强,因此可以确定DF对荧光假单胞菌的MIC值为12.5 μg/mL,MBC值为800 μg/mL。在郭嘉亮等[11]的研究中采用1/2 MIC溴代2-(5H)-呋喃酮的化合物浓度对绿脓杆菌进行实验,而在本实验中探索到1MIC(12.5 μg/mL)、5 MIC(800 μg/mL)DF对荧光假单胞菌的作用,因此在后续实验分别选择1MIC和5 MIC作为工作浓度。

2.2 DF对生物膜的抑制作用

2.2.1 DF作用下的荧光假单胞菌生物膜与浮游菌生长曲线 生物膜生长为非线性生长模型,易黏附在硅胶引导片上[12]。如图1A所示,0～12 h为生物膜菌落数快速增长期。12～48 h为生物膜快速增长期,形成成熟的生物膜,此时菌落形态良好,最接近最大活菌数。48～72 h生物膜生长的停滞期,菌落分泌大量胞外聚合物,出现菌落融合成片现象,导致可数菌落数不再增多甚至减少,这也与前人研究结果相似[13]。通过对比荧光假单胞菌生长曲线可以看出,1MIC组荧光假单胞菌与对照组趋势基本一致,在48 h后出现生长显著降低(p<0.05),而5 MIC组从6 h开始细菌总量就明显低于1MIC组和对照组,表明DF能够抑制荧光假单胞菌的生长,这种抑制作用随DF的作用时间和浓度而改变。

图1B为荧光假单胞菌的浮游细菌数变化,在1MIC浓度DF作用下,浮游细菌数增长趋势与对照组基本一致,但在5 MIC浓度作用下,DF延缓了细菌进入快速增长期与平稳期的时间点,可见5 MIC浓度DF的抑菌效果较明显。

QS系统全程调节细菌生物膜的形成,根据本实验结果显示,在1MIC和5 MIC时,DF作用于荧光假单胞菌72 h的生物膜形成抑制率(9.63%±0.46%,23.5%±4.32%)均明显高于其对浮游细菌24 h的抑制率(8.48%±0.42%,18.02%±2.49%),这表明作为QS通路抑制剂的DF可通过干扰其QS系统而影响细菌生物膜的形成。

图1 溴代呋喃酮作用下荧光假单胞菌生物膜细菌与浮游菌生长曲线Fig.1 Growth curve of Pseudomonas fluorescens biofilm and planktonic colonies on the effect of bromo-furanone注：A为生物膜细菌,B为浮游细菌。

2.2.2 DF作用下的荧光假单胞菌群集运动能力 细菌的群集运动是其依赖鞭毛以及强大的生物膜表面活性物质的迁移运动,是细菌表面迁移的最快形式[11],QS系统通过对鞭毛操纵子的调控来调控细菌的群集运动[14]。DF通过抑制QS系统来抑制菌体的群集能力,从而影响菌体的运动能力[15]。根据图2A与2B对比发现,DF能够显著的抑制荧光假单胞菌菌体群集运动,进而破坏菌体生物膜的形成。这表明DF通过对荧光假单胞菌群集运动能力的抑制作用进一步影响了其生物膜的形成。

图2 溴代呋喃酮对荧光假单胞菌群集运动能力的影响Fig.2 The effect of bromo-furanone on swarming motility capacity of Pseudomonas fluorescens注：A:对照;B:5MIC组。

2.2.3 DF作用下的荧光假单胞菌生物膜银染法鉴定 由图3A可见,培养24 h的硅胶片经银染后,硅胶表面形成密集的菌落,可以观察到有黑色的棉絮样团块状物,表明此时荧光假单胞菌生物膜形成较为成熟。当加入1MIC的DF(图3B),细菌多以分散的较为密集的形式存在;加入5 MIC的DF(图2C),其抑制菌体生长较为显著,部分区域只发现稀少的块状分布,以单个菌落或碎片形式存在。在郭嘉亮等[16]的研究中发现DF对绿脓杆菌也有同样的抑制作用,DF通过抑制荧光假单胞菌信号联导分子的产生,阻止细菌聚集在一起,从而阻止生物膜的形成。通过OD值比较细菌群落总数计算1MIC和5 MIC的DF对荧光假单胞菌生物膜形成,抑制率分别为20.59%±2.91%和99.54%±1.83%。

图3 不同浓度DF作用下的荧光假单胞菌生物膜Fig.3 Biofilms of Pseudomonas fluorescens at different concentrations of bromo-furanone注：A、B、C分别为对照组、DF的1MIC组、DF的5MIC组。

2.3 DF对荧光假单胞菌生物膜总蛋白、生物膜胞外多糖含量的影响

菌体在QS过程中产生一类信息素AHLs,能与LuxI蛋白和LuxR蛋白结合并激活细胞基因的转录表达[4,17]。DF为AHLs的类似物,在其低浓度时就能影响受体蛋白与信号分子结合,抑制QS系统启动它所调控的基因表达,从而对菌分泌蛋白的合成起到一定的抑制作用,且浓度越大抑制效果越明显。如图4对照组所示,荧光假单胞菌菌体在8 h后进入了快速生长期,细菌大量繁殖,总蛋白合成量增多;20 h后,菌体进入稳定期,细菌数达到最大值,总蛋白合成量最大。随着时间的变化,荧光假单胞菌总蛋白合成波动起伏,但总体呈现增长的趋势,加入DF后,假单胞菌总蛋白合成总体呈现增长的趋势,但是增长幅度明显低于对照组,而且浓度越高抑制效果越明显,24 h时5 MIC的DF对荧光假单胞菌总蛋白合成量的抑制率(8.04%±0.37%)显著高于(p<0.05)1MIC的(2.77%±0.08%),这表明DF可以抑制荧光假单胞菌总蛋白合成。

QS通过刺激细菌胞外多糖分泌影响细菌生物膜形成[18]。胞外多糖通过降解一些高分子物质以被菌体利用进而包裹细菌提高生物膜结构稳定性,QS可以调控胞外多糖的产生量及成分变化,从而对细菌粘附性产生影响,继而影响生物膜结构[19]。结果显示,DF具有明显抑制胞外多糖分泌的效果,这表明DF通过抑制QS系统的胞外多糖分泌来抑制细菌生物膜的形成。如图5对照组所示,荧光假单胞菌多糖的分泌与蛋白的分泌趋势是一致的,都是随着时间延长,分泌量呈现增加的趋势。从8 h开始细菌进入快速增长期;20 h后多糖含量稳定,菌体增长速度减缓,生物膜形成渐趋成熟,与对照组相比,24 h时1MIC和5 MIC浓度DF对细菌多糖分泌具有抑制效果,5 MIC(51.08%±2.71%)抑制荧光假单胞菌多糖的分泌强于MIC(25.51%±1.54%),表明DF浓度越高,对荧光假单胞菌多糖的分泌抑制作用就越强,但是多糖和蛋白并不能代表DF抑制QS系统的全部抑制因子,这也就是1MIC组虽然对多糖和蛋白都有明显抑制作用,但是在细菌生物膜形成的抑制中作用并不明显,但是当1MIC浓度达到5 MIC时,抑制作用就非常明显,这表明细菌生物膜的抑制作用与DF的浓度有关。

图4 不同浓度溴代呋喃酮作用下荧光假单胞菌蛋白含量的变化曲线Fig.4 Total protein content of Pseudomonas fluorescens under the effect of BF

图5 不同浓度溴代呋喃酮作用下荧光假单胞菌总糖含量的变化曲线Fig.5 Polysaccharide content of Pseudomonas fluorescens under the effect of BF

3 结论

细菌生物膜是一种具有协调性、功能性和高度结构性的膜状复合物[20],其表面包被多聚糖基质,内部包含众多输送养料的管道,适应能力强,是细菌对抗生素耐药的主要原因,据估计超过60%的微生物感染是由细菌的生物被膜引起的[21]。本文通过DF对荧光假单胞菌生物膜形成研究和定性观察,探讨了DF影响荧光假单胞菌生物膜的形成规律和外部条件,研究发现DF浓度为MIC和5 MIC时,DF作用于荧光假单胞菌24 h,银染法鉴定生物膜形成抑制率分别为20.59%±2.91%和99.54%±1.83%,并能明显抑制荧光假单胞菌的群集运动能力,干扰荧光假单胞菌QS系统而影响其总蛋白合成及多糖的含量,可为预防或抑制生物膜在食品中的形成提供参考,为寻找新型抗菌药提供实验依据,但DF改变QS抑制生物膜形成的具体机制仍有待进一步研究。

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Effectof3,4-dibromo-2(5H)-furanoneasanaturalquorumsensinginhibitoronbiofilmformationofPseudomonasFluourcens

XINGJia-li1,2,CHENShan-shan2,ZHOUZi-yan1,SHENJian1,MAChao-yi2,LUZhao-jun2,SHIYue-lan2,WANGYi2,DAIXian-jun2,ZHENGRui-hang1,*

(1.Ningbo Institute for Food Control,Ningbo315000,China;2.College of Life Science,China Jiliang University,Hangzhou310018,China)

In order to research the inhibiting effect of3,4-dibromo-2(5H)-furanone(DF)on biofilm formation ofPseudomonasFluourcens.The effect of DF on minimum inhibitory concentration(MIC),minimum bacterial concentration(MBC)values and growth curve ofPseudomonasfluorescensaccording the biofilm model of24orifice plate and silicon rubber were calculated by CFU counting method.The biofilmand the cluster movement ability of bacteria was studied at MIC and5MIC of DF,and the inhibiting rate of formation the contents of total protein synthesis and polysaccharide were examined. The results showed that the MIC and MBC values of DF onPseudomonasfluorescenswere12.5μg/mL and800μg/mL,respectively. The inhibitting rates of biofilm formation ofPseudomonasfluorescenswere20.59%±2.91% and99.54%±1.83% on24h at the concentration of1MIC and5MIC of DF. DF could inhibite the cluster movement and disturb the quorum sensing,there by had an effect on the total protein and extracellular polysaccharides content ofPseudomonasfluorescens. The inhibitting rates of total protein and extracellular polysaccharides content ofPseudomonasfluorescenswere8.04%±0.37% and51.08%±2.71% on24h at the concentration of5MIC of DF.In this paper,the reason of DF’s effect on the formation ofPseudomonasfluorescensbiofilm was studied.The inhibition of DF onPseudomonasaeruginosabiofilm formation and its interference with QS pathway have good theoretical and practical reference.

3,4-dibromo-2(5H)-furanone;Pseudomonasfluorescen;biofilm;inhibiting effect

2017-05-02

邢家溧(1988-)，女，博士，研究方向：食品质量安全检验，E-mail:hellojiali77@gmail.com。

*通讯作者:郑睿行(1982-)，男，硕士，高级工程师，研究方向：食品质量安全检验，E-mail:13865867@qq.com。

浙江省食品药品监管系统科技计划项目(SP201617)；浙江省科技项目(2012C03009-2)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)23-0114-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.23.023