中华绒螯蟹细胞色素CYP2基因的克隆与表达分析

蒲红双，侯红漫，高祥刚，赫崇波，张公亮，许艺迪，鲍相渤，刘卫东

( 1. 大连工业大学 食品学院，辽宁 大连 116034； 2. 辽宁省海洋水产科学研究院，辽宁省海洋水产分子生物学重点实验室，辽宁 大连 116023 )

中华绒螯蟹细胞色素CYP2基因的克隆与表达分析

蒲红双1,2，侯红漫1，高祥刚2，赫崇波2，张公亮1，许艺迪2，鲍相渤2，刘卫东2

( 1. 大连工业大学 食品学院，辽宁 大连 116034； 2. 辽宁省海洋水产科学研究院，辽宁省海洋水产分子生物学重点实验室，辽宁 大连 116023 )

为研究细胞色素CYP2基因在中华绒螯蟹蜕皮及生长发育中的作用，本试验通过逆转录聚合酶链式RT-PCR反应以及cDNA末端快速扩增RACE技术获得了中华绒螯蟹CYP2基因cDNA全长。用实时荧光定量PCR技术，分析该基因在中华绒螯蟹蜕皮过程中各组织的相对表达量。试验结果显示，中华绒螯蟹CYP2的 cDNA全长1772 bp，编码491个氨基酸序列，包括一个84 bp的5′端非编码区，一个212 bp的3′端非编码区、一个1475 bp的开放阅读框，经BLAST比对，该核苷酸序列与岸蟹、三疣梭子蟹的相似性分别为66%、64%。实时荧光定量PCR结果显示，中华绒螯蟹蜕皮前，CYP2基因在鳃中的表达量相对最高；在肝胰脏、肌肉中表达量略低于鳃；在Y器官、眼柄、胸神经节、脑神经节、肠中少量表达；在心和胃中表达量最低。中华绒螯蟹在不同的蜕皮时期中，通过荧光定量试验得出，肝胰脏中CYP2基因表达量在蜕皮前期和蜕皮期最高；眼柄中CYP2基因表达量从蜕皮期到蜕皮后期有上升趋势；鳃中CYP2基因表达量在蜕皮前期最高；Y器官、脑神经节和肠中CYP2基因表达量在蜕皮期最高；肌肉中CYP2基因表达量在蜕皮前期最高；胸神经节和胃中CYP2基因表达量在蜕皮后期最高；Y器官中CYP2基因在蜕皮前期表达量高于蜕皮后期和蜕皮期。以上试验结果表明，CYP2对中华绒螯蟹蜕皮生长中的调控可能起到重要作用。

中华绒螯蟹；CYP2；蜕皮；基因克隆

目前越来越多的研究证实，甲壳动物的蜕皮生长过程需要多种激素协同调控，蜕皮激素在甲壳动物蜕皮生长过程中起到关键性的作用[1-3]。蜕皮激素在甲壳动物中的存在方式多种多样，而其主要的是以 20-羟蜕皮甾酮(20E) 形式存在。细胞色素P450酶系(CYP)是广泛存在于生物体内的一类代谢酶系。 细胞色素P450酶系家族成员在 20E 合成和降解中发挥重要作用[4]。细胞色素P450酶系作为本家族中最为古老的家族之一，它参与外源和内源物质在动植物等体内的代谢和转化。细胞色素P450研究最先见于昆虫，受各种外源物质的诱导，而细胞色素P450家族在相关研究中证明其在甲壳动物蜕皮中也起到重要的调节作用[5-7]。

中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)在我国广泛分布于辽河、黄河、长江、瓯江和闽江等江河流域，其肉味鲜美、营养丰富[8]。自 20 世纪 80 年代以来，中华绒螯蟹养殖业发展迅速，目前已成为水产养殖支柱产业之一[9]。螃蟹的生长离不开蜕皮，而细胞色素P450与螃蟹的蜕皮有很大的相关性。因此研究CYP2基因在中华绒螯蟹蜕皮生长中的作用，具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

取自盘锦野生中华绒螯蟹(体质量约70 g)，暂养于养殖室，使用泵氧系统，模拟自然生长环境，投喂养殖饲料。用解剖剪活体解剖3只中华绒螯蟹心、Y器官、眼柄、肝胰脏、肌肉、胸神经节、脑神经节、肠、鳃、胃，用于组织表达分析。将中华绒螯蟹分为蜕皮后期、蜕皮间期、蜕皮前期和蜕皮期[3]。各取3只蜕皮后期、蜕皮前期、蜕皮期的中华绒螯蟹的心、Y器官、眼柄、肝胰脏、肌肉、胸神经节、脑神经节、肠、鳃、胃，用于蜕皮周期中CYP2基因相对表达量分析。将新鲜组织器官放液氮中暂时冷冻，待解剖结束将样品保存于冰箱-80 ℃备用。

1.2 总RNA的提取和cDNA的合成

取上述中华绒螯蟹的各组织于液氮中研磨，使用TIANGEN 动物组织总RNA提取试剂盒进行总RNA的提取，核酸蛋白测定仪(NanoPhotometer)与1.0%琼脂糖凝胶电泳检测其质量及完整性。

取中华绒螯蟹肝胰脏组织提取的总RNA为模板，按照PrimerscriptTMReverse transcriptase (TaKaRa)试剂盒说明书反转录合成cDNA用于基因序列的克隆。分别提取蜕皮周期中各时期的上述10种组织样品的RNA，使用Primescript RT Reagent Kit (TaKaRa)试剂盒进行反转，将得到的cDNA存于冰箱中-20 ℃保存备用。

1.3 中华绒螯蟹CYP2基因的cDNA片段的克隆

根据GenBank中岸蟹的CYP2基因保守区域设计上下游引物ESCYP-1/ESCYP-2，由上海生工生物工程有限公司合成引物(表1)。以上述中华绒螯蟹肝胰脏的cDNA为模板，ESCYP-1/ESCYP-2为引物进行CYP2基因cDNA的扩增。PCR扩增体系为25 μL，cDNA模板1 μL，dNTP Mixture (2.5 mmol/L) 4 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，10×Buffer 2.5 μL，LATaq酶(5 U/μL) 0.25 μL，加灭菌超纯水至总体积25 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，32个循环；最后72 ℃延伸10 min。1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，后送上海生物工程有限公司进行测序。

表1 中华绒螯蟹CYP2基因克隆和定量PCR所用的引物

1.4 CYP2基因全长的克隆

根据已经获得的CYP2基因片段设计3′RACE outer Primer ESCYP-3/inner Primer ESCYP-4和5′RACE outer Primer ESCYP-5/inner Primer ESCYP-6(表1)引物，按照3′-Full RACE Core Set with PrimeScriptTMRTase (TaKaRa) 和5′-Full RACE Kit with TAP (TaKaRa)说明书的反应体系和反应条件进行CYP2基因3′和5′端序列的扩增。产物送上海生工生物工程有限公司测序。

1.5 生物学信息分析

用ORF finder 软件(http:∥ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)确定开放阅读框；用BLAST (http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov /Blast.cgi)、PrimerPremier 5.0生物学软件将中华绒螯蟹CYP2的cDNA全长翻译成氨基酸序列；用Protparam (http://web.expasy.org/protparam)程序预测氨基酸序列物理参数；用BioEdit软件进行序列同源性比对；用SigalP 3.0 server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)预测信号肽；用Mega 5.0软件进行邻接系统进化树的构建并用Phylip和MrBayes软件采用最大似然法和贝叶斯法进行验证。

1.6 实时荧光定量PCR

参照获得的中华绒螯蟹CYP2基因全长cDNA序列，利用PrimerPremier 5.0和FPCR软件设计一对定量PCR的特异性引物ESCYP-7/ESCYP-8(表1)，用于CYP2基因的荧光定量分析，并应用内参引物Actin-S/Actin-R[10]量化分析CYP2在中华绒螯蟹不同组织和不同生长周期各组织的表达差异。定量PCR反应条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s。样本和内参分别设置3个平行。试验使用STRATAGENE Mx3005p Real-Time PCR荧光定量PCR仪，采用2-ΔΔCt法进行数据分析，用Excel软件进行显著性分析，P<0.05为差异显著。

2 结 果

2.1 CYP2基因cDNA的序列分析

以中华绒螯蟹肝胰脏总RNA为模板扩增得到的cDNA序列全长1772 bp(GenBank登录号：KT159166)，编码491个氨基酸序列，包括一个84 bp的5′端非编码区、一个212 bp的3′端非编码区、一个1475 bp的开放阅读框 (ORF)，编码491个氨基酸。根据ProtParam tool软件分析预测CYP2的分子式为C2592H3954N658O709S15，分子量大小为56 158.7 u，理论等电点为6.05，亮氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸含量相对较高，分别为11.4%、8.6%、6.9%。加尾信号(AATAA)以及Poly-A见图1。经BLASTx以及多序列比对表明，该氨基酸序列与岸蟹(Carcinusmaenas)、三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)等的CYP450氨基酸序列具有很大的相似性(图2)，由此确定该序列为中华绒螯蟹CYP2基因的cDNA序列。

图1 中华绒螯蟹CYP2基因的cDNA序列及预测的氨基酸序列小写字母分别表示5′、3′非编码区，大写字母代表编码区序列，上面为核苷酸序列，下面对应为编码的氨基酸序列；椭圆形框内ATG代表起始密码子，*表示终止密码子，阴影部位表示信号肽序列，下划线“aataa”为多聚腺苷氨酸加尾信号，长方形框内代表血红素结合区保守序列(FXXGXXXCXG), 双下划线为K螺旋保守序列(ExxR).

图2 中华绒螯蟹CYP2氨基酸序列比对GenBank 登录号：Carcinus maenas (岸蟹：ACI94903.1)，Portunus trituberculatus (三疣梭子蟹：AHZ97878.1)，Eriocheir sinensis (中华绒螯蟹：KT159166).

2.2 CYP2基因比对及系统进化树分析

将中华绒螯蟹CYP2基因氨基酸序列与岸蟹、三疣梭子蟹等CYP2氨基酸进行比对，其相似性为66%和64%。利用Mega 5.0软件进行邻接法构建相关氨基酸的系统进化树。结果显示，甲壳动物聚为一支，昆虫聚为一支，鱼类聚为一支(图3)。

图3 利用 MEGA 5.0 软件构建的基于CYP2家族的基因序列的NJ系统进化树GenBank 登录号 ：Carcinus maenas (岸蟹：ACI94903.1)，Portunus trituberculatus (三疣梭子蟹：AHZ97878.1)，Eriocheir sinensis (中华绒螯蟹：KT159166)，Stegodyphus mimosarum (隆头蛛：KFM58273.1)，Fundulus heteroclitus (鳉科硬骨鱼：XP_012721843.1)，Tigriopus japonicus (日本虎斑猛水溞：AIL94139.1)，Oryzias melastigma (海水青鳉：AGN04335.1) Laodelphax striatella (灰飞虱：AGI92302.1), Pseudosciaena crocea(大黄鱼：KKF12365.1), Nilaparvata lugens (褐飞虱：AIW79970.1), Zootermopsis nevadensis (白蚁：KDR21921.1), Chaetodon mertensii (橙尾蝶：ABO21082.1), Pediculus humanus corporis (人体虱：XP_002427451.1)，Daphnia pulex ( 淡水枝角水溞：EFX85356.1), Danio rerio (斑马鱼： XP_001337781.3), Camponotus floridanus (弓背蚁XP_011253751.1).

2.3 CYP450在中华绒螯蟹各组织的表达

以CYP-5/CYP-6为荧光定量 PCR 引物，中华绒螯蟹心、Y器官、眼柄、肝胰脏、肌肉、胸神经节、脑神经节、肠、鳃、胃等10个组织的cDNA为模板，Actin-s/Actin-R为内参基因，利用荧光定量PCR方法研究中华绒螯蟹CYP2 mRNA的组织表达特征，设定中华绒螯蟹CYP2基因在心中的表达量为1，根据CYP2基因在各个组织中的相对表达量作柱形图(图4)。由图4可知，CYP2基因在所有检测的组织中均有表达，且在中华绒螯蟹鳃中表达量最高，其次是肝胰脏和肌肉(P<0.05)；心、Y器官、眼柄、胸神经节、脑神经节、肠和胃中有少量表达。

取蜕皮前期、蜕皮期、蜕皮后期中华绒螯蟹典型的10 个组织，心、Y器官、眼柄、肝胰脏、肌肉、胸神经节、脑神经节、肠、鳃、胃，利用荧光定量 PCR 方法检测CYP2 mRNA 在这些组织中的表达情况。设定中华绒螯蟹CYP2基因在蜕皮前期心中的表达量为1，根据 CYP2 基因在各蜕皮阶段10个组织中的相对表达量作柱形图(图5)。荧光定量 PCR 结果显示，在中华绒螯蟹不同蜕皮时期中，心中CYP2基因在蜕皮前期表达量最高，显著高于其他时期(P<0.05)；Y器官中CYP基因表达量在蜕皮期表达量最高，略高于其他时期(P<0.05)；眼柄中CYP2基因表达量从蜕皮前期到蜕皮后期呈上升趋势(P<0.05)；肝胰脏中CYP2基因表达量在蜕皮期最高，与蜕皮后期、蜕皮前期呈显著性差异(P<0.05)；肌肉中CYP2基因表达量在蜕皮前期最高，与其他各蜕皮时期呈显著性差异(P<0.05)；胸神经节中CYP2基因表达量在蜕皮后期最高，显著高于其他时期(P<0.05)；脑神经节中CYP2基因表达量在蜕皮期最高(P<0.05)；肠和胃中CYP2基因在各时期表达量无显著性差异(P>0.05)；鳃中CYP2基因表达量在蜕皮前期最高，蜕皮后期显著高于蜕皮期(P<0.05)。

图4 中华绒螯蟹CYP2基因在各组织中的相对表达情况

图5 中华绒螯蟹CYP2基因在不同蜕皮时期各组织中的相对表达情况

3 讨 论

细胞色素P450酶系参与多种外源物质(亲脂药物、有机污染物、环境致癌物质等)和内源物质(蜕皮激素、保幼激素、类固醇及类固醇衍生物、脂肪酸等) 在生物体内的转化、合成与代谢过程[5-7,11-12]。相关研究表明，细胞色素P450广泛存在于同一生物体中的各个组织部位并且表达量均有不同。当外源物质进入哺乳动物时，其主要通道是肝胰脏、肺、消化道及皮肤等；而在鱼类等动物体中，则主要入口为鳃、肾及肝胰脏等。冯艳艳等[13]的相关研究表明CYP450在三疣梭子蟹的肝胰腺中表达最多，其他研究者在岸蟹[14]的研究中也有类似结果。

据Nebert等[15]命名法则：依据氨基酸序列的相似程度来确定不同基因所属的家族与亚家族规定，同一家族的基因成员氨基酸序列相似性达到40%以上；同一亚家族成员，氨基酸序列相似性达到55%以上。Nelson等[16]提出了依据氨基酸序列的同源性和系统发育学来划分CYP450超家族的系统命名法：CytochromoP450用英文缩写CYP表示。同一家族的氨基酸序列相似性应该高于40%，用CYP后面跟一具体数字表示，如CYP1、CYP2、CYP3和CYP4等；同一亚家族的氨基酸序列相似性高于55%，用大写英文字母表示，如CYP1A、CYP2L等；同一亚家族中不同亚型的功能具有相似性，按照这些亚型被鉴定的先后顺序，用阿拉伯数字进行编号，如CYP1A1和CYP4C2等。通过BLASTX比对，中华绒螯蟹序列与岸蟹CYP379A1相似性达到66%，与三疣梭子蟹的CYP2相似性达到64%。Dam等[14]研究表明，CYP2与CYP379A1同属于一个功能家族，其组织表达部位相同，在肝胰脏表达量最多。通过该序列的功能作用及命名法则，我们将获得的中华绒螯蟹序列命名为CYP2。

虽然CYP450包括很多家族，而且各家族参与催化的底物种类和反应类型之间具有差异性，但是在结构上仍然保留着一些共同的保守区域，即CYP基因家族所特有的K螺旋保守序列(ExxR)和血红素结合区(FxxGxxxCxG)[17]。在GenBank中进行BLASTX同源性比对，中华绒螯蟹CYP2基因与甲壳类动物及昆虫的细胞色素P450基因家族的氨基酸序列有很高的相似性。从系统进化树分析发现。甲壳类动物的CYP2家族基因聚为一支，符合物种的分子进化关系。

柳志业等[2]在三疣梭子蟹中克隆了CYP302A1；Kim等[18]在岸蟹中克隆出CYP330A1[3]；艾均文等[6]研究发现CYP家族的第一个基因(CYP337A1)并进行基因克隆与序列分析。张晓燕等[7]在三疣梭子蟹中克隆出CYP4C基因，娄绘芳等[19]在大黄鱼中克隆出CYP4F7基因；Akira 等[12]在斑马鱼中克隆出CYP2AA2基因；冯艳艳等[13]在三疣梭子蟹中克隆出CYP2基因；Boyle等[20]在佛罗里达龙虾(Procambarusalleni)肝胰腺中又克隆出多条CYP2L基因，CYP家族基因在各个物种中都陆续被发现。

由CYP2基因在中华绒螯蟹蜕皮周期心、Y器官、眼柄、肝胰脏、肌肉、胸神经节、脑神经节、肠、鳃、胃中的表达情况可知，鳃中的表达量较高，肝胰脏和肌肉其次，其他各组织也都有表达。CYP2基因在各组织中均有表达，这与其他学者的研究相同；但冯艳艳等[13]发现，CYP2基因在甲壳动物肝胰脏中表达量最高，鳃、肌肉等相对表达量为其次，与本试验结果存在差异。但CYP2基因在蜕皮后期、蜕皮期等各组织部位相对表达量分析表明，蜕皮期时肝胰脏相对表达量最高，明显高于鳃等组织的相对表达量，说明CYP2基因在肝胰脏中的相对表达量影响着甲壳动物的蜕皮。在蜕皮期，甲壳动物蜕皮所需蜕皮激素增加，CYP2的相对含量积累的最多；在蜕皮后期，甲壳动物蜕皮接近尾声时CYP2基因的相对表达量最低，说明在甲壳动物蜕皮的这个周期中，CYP2 大量消耗，以至于在蜕皮周期即将结束时候CYP2含量降低。许多研究者发现，CYP450 在各组织中的分布具有明显的选择性，例如研究发现药物代谢的主要场所为肝胰脏[21]，CYP450家族的含量在这个器官也最多。而作为外源物质进入体内第一道防线的鳃和皮肤等组织，其含量也相对较高。对于CYP450 的这种选择性分布，研究者怀疑其在生物体内发挥着重要的作用[13]。

本试验首次克隆得到了中华绒螯蟹CYP2基因的cDNA全长，其蜕皮周期各组织器官表达分析进一步说明，CYP2基因在中华绒螯蟹蜕皮周期中可能具有重要的调节作用，本试验为深入研究CYP2基因在甲壳动物蜕皮调控中的作用奠定了良好的基础。

[1] Chen H Y, Watson R D, Chen J C, et al. Molecular characterization and gene expression pattern of two putative molt-inhibiting hormones fromLitopenaeusvannamei[J]. General & Comparative Endocrinology, 2007, 151(1):72-81.

[2] 柳志业, 朱冬发, 谢熙, 等. 三疣梭子蟹CYP302a1基因克隆及其表达分析[J]. 水产学报, 2015, 39(5):628-637.

[3] 王瑶, 杨志刚, 沈城. 中华绒螯蟹EcR基因全长cDNA克隆及表达分析[J]. 水产学报, 2014, 38(5): 651-660.

[4] 蒲红双, 高祥刚, 侯红漫, 等. 甲壳动物蜕皮相关基因的研究进展[J]. 水产科学, 2015,34(6):391-398.

[5] Wang B, Shahzad M F, Zhang Z, et al. Genome-wide analysis reveals the expansion of cytochrome P450 genes associated with xenobiotic metabolism in rice striped stem borer,Chilosuppressalis[J]. Biochemical & Biophysical Research Communications, 2014, 443(2):756-760.

[6] 艾均文, 董元凌, 孔卫青,等. 细胞色素P450新家族的第一个基因CYP337A1的分子克隆与序列分析[J]. 西南大学学报:自然科学版, 2008, 30(2):51-58.

[7] 张晓燕, 李健, 刘萍, 等. 三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus) CYP4C基因的 cDNA 克隆及表达分析[J]. 海洋与湖沼, 2014, 45(1):73-79.

[8] 孔晓瑜, 喻子牛, 刘亚军, 等. 中华绒螯蟹与日本绒螯蟹线粒体COⅠ基因片段的序列比较研究[J]. 青岛海洋大学学报:自然科学版, 2001, 31(6):861-866.

[9] 宋林生, 季延宾, 蔡中华, 等. 温度骤升对中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis) 几种免疫化学指标的影响[J]. 海洋与湖沼, 2004, 35(1):74-77.

[10] Gong Y N, Li W W, Sun J L, et al. Molecular cloning and tissue expression of the fatty acid-binding protein (Es-FABP) gene in female Chinese mitten crab (Eriocheirsinensis)[J]. BMC Molecular Biology, 2010, 11(2):71.

[11] Li F, Ni M, Zhang H, et al. Expression profile analysis of silkworm P450 family genes after phoxim induction[J]. Pesticide Biochemistry & Physiology, 2015(122):103-109.

[12] Akira K, Bainy A C D, Woodin B R, et al. The cytochrome P450 2AA gene cluster in zebrafish (Daniorerio): expression of CYP2AA1 and CYP2AA2 and response to phenobarbital-type inducers[J]. Toxicology & Applied Pharmacology, 2013, 272(1):172-179.

[13] 冯艳艳, 李健, 张德宁, 等. 三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus) CYP2基因的cDNA克隆及表达分析[J]. 海洋与湖沼, 2014, 45(5):73-79.

[14] Dam E, Rewitz K F, Styrishave B, et al. Cytochrome P450 expression is moult stage specific and regulated by ecdysteroids and xenobiotics in the crabCarcinusmaenas[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2008, 377(4):1135-1140.

[15] Nebert D W, Adesnik M, Coon M J, et al. The P450 gene superfamily: recommended nomenclature[J]. DNA, 1987, 6(1):1-11.

[16] Nelson D R, Koymans L, Kamataki T, et al. P450 superfamily: update on new sequences, gene mapping, accession numbers and nomenclature[J]. Pharmacogenetics and Genomics, 1996, 6(1):1-42.

[17] 冷欣夫，邱星辉. CYP450 酶系的结构、功能与应用前景[M]. 北京: 科学出版社, 2001.

[18] Kim R, Bjarne S, Ole A. CYP330A1 and CYP4C39 enzymes in the shore crabCarcinusmaenas: sequence and expression regulation by ecdysteroids and xenobiotics[J]. Biochemical & Biophysical Research Communications, 2003, 310(2):252-260.

[19] 娄绘芳, 黄艳青, 吴信忠. 大黄鱼(Pseudosciaenacrocea) 细胞色素 P450 CYP4F7基因的克隆及表达分析[J]. 海洋学报, 2008, 30(4):131-138.

[20] Boyle S M, Greenberg R M, James M O. Isolation of CYP2L2 and two other cytochrome P450 sequences from a spiny lobster,Panulirusargus, hepatopancreas cDNA library[J]. Marine Environmental Research, 1998, 46(1):21-24.

[21] Sun Y, Zhang Y, Liu Y, et al. Changes in the organics metabolism in the hepatopancreas induced by eyestalk ablation of the Chinese mitten crabEriocheirsinensisdetermined via transcriptome and DGE analysis[J]. Plos One, 2014, 9(4):e95827.

cDNACloningandExpressionAnalysisofCYP2GeneinChineseMittenCrabEriocheirsinensis

PU Hongshuang1,2, HOU Hongman1, GAO Xianggang2, HE Chongbo2, ZHANG Gongliang1, XU Yidi2, BAO Xiangbo2, LIU Weidong2

( 1. College of Food Science Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China; 2. Key Lab of Marine Fishery Molecular Biology of Liaoning Province, Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute, Dalian 116023, China )

The full-length cDNA of CYP2 gene was cloned using reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) and rapid-amplification of cDNA ends (RACE) to study the regulation of CYP2 gene in molting in Chinese mitten crabEriocheirsinensis. Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) was used to quantify the relative expression level of CYP2 in different tissues and molting process in Chinese mitten crab. The results showed that the full-length cDNA sequence of CYP2 was 1772 bp, a 5′-untranslated region (UTR) of 84 bp, and a 3′-UTR of 212 bp and included a 1475 bp ORF encoding 491 amino acid residues. The alignment of CYP2 amino acid sequence of in Chinese mitten crab showed that it shared 66% identity with crabCarcinusmaenasand shared 64% identity with swimming crabPortunustrituberculatus. The CYP2 mRNA was expressed in all tissues examined and highly in gills. CYP2 expression was slightly lower in hepatopancreas and muscle than in the gills, with small amount in Y organs, eye stalk, horaci ganglion, cerebral ganglion, and intestines and trace in heart and stomach. During the molting process, the expression levels of CYP2 mRNA of hepatopancreas was the maximum in D and E period. The amount of CYP2 expression in eye stalk was rising from E period to AB period, and CYP2 expression in gills was the maximum in D and AB period. CYP2 expression in Y organs, cerebral ganglion and intestines was the maximum in E period. CYP2 expression in muscle was the maximum in D period. CYP2 expression in thoracic ganglion and stomach was the maximum in AB period, and in Y organs higher in D period than in AB and E periods. The findings indicate that CYP2 might play an important role in regulation of the molting process.

Eriocheirsinensis; CYP2; molting; gene cloning

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.02.006

2015-09-11；

2016-07-28.

国家自然科学基金资助项目(31302178)；辽宁省科学事业公益研究基金资助项目(2016004005).

蒲红双(1990-)，女，硕士研究生；研究方向: 食品科学. E-mail: phsdlgy@163.com.通讯作者： 高祥刚(1980-)，男，副研究员；研究方向: 动物分子遗传学. E-mail: xiangganggao@163.com.

Q786

A

1003-1111(2017)02-0153-07